Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

Las técnicas de cultivo celular han dado lugar a numerosos avances en diversos campos de la neurofisiología celular en la salud y la enfermedad. En particular, los cultivos celulares primarios, recién aislados del tejido neuronal de un animal de laboratorio, permiten al experimentador estudiar de cerca el comportamiento de diversas células en diferentes medios bioquímicos y configuraciones fisiológicas. El uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como los colorantes sensibles al Ca²⁺ en combinación con la microscopía de video de lapso de tiempo, proporciona una mejor comprensión de los procesos biofísicos y bioquímicos celulares en tiempo real.

La ELA es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores¹. La enfermedad tiene una patogénesis compleja de tipo familiar, pero principalmente de forma esporádica (90% de los casos)². Es bien sabido que los mecanismos autónomos no celulares contribuyen a la fisiopatología de la ELA, principalmente debido al papel esencial de las células gliales³. La ELA también se caracteriza bien como una enfermedad neuroinflamatoria con la participación de factores humorales y celulares de inflamación.

La inmunoglobulina G es ampliamente utilizada como marcador molecular en la ELA y otras enfermedades neurodegenerativas. El estudio del nivel sérico de este marcador puede indicar la presencia y el estadio de la neuroinflamación en la enfermedad ^4,5,6, mientras que su presencia en el líquido cefalorraquídeo puede indicar una ruptura de la barrera hematoencefálica⁷. Las IgG también fueron identificadas como depósitos en las neuronas motoras de la médula espinal de pacientes con ELA⁷. Sin embargo, este abordaje ha mostrado algunas inconsistencias en la correlación del nivel de IgG con el estadio y las características de la enfermedad⁶.

La IgG aislada de sueros de pacientes con ELA (ALS IgG) puede inducir una respuesta al calcio en^{astrocitos 8} naïve y la liberación de glutamato en las neuronas, apuntando a un efecto excitotóxico, un sello distintivo de la patología de ELA⁹. Sin embargo, los estudios en el modelo de rata hSOD1^G93A ALS (que contiene múltiples copias de la mutación SOD1 humana¹⁰) mostraron una serie de marcadores de estrés oxidativo en células neurogliales cultivadas 11, tejidos 12,13,14 o animales vivos ¹³. Cabe destacar que los astrocitos cultivados del modelo de rata ALS fueron más propensos al estrés oxidativo inducido por el peróxido que la astroglía de compañeros de camada no transgénicos¹¹.

Las células microgliales en cultivo se ven afectadas por la ELA IgG de una manera menos aparente. A saber, una línea celular microglial BV-2 mostró un aumento en la señal de marcadores fluorescentes de estrés oxidativo en respuesta a la aplicación de solo 4/11 muestras de pacientes con ELA^{IgG 15}. Es bien sabido que la microglía participa en muchas patologías neuroinflamatorias, añadiendo estrés oxidativo y fase de progresión tardía en el mecanismo autónomo no celular de ALS^16,17. Sin embargo, los datos con ALS IgG indicaron que estas células pueden no ser tan reactivas como los astrocitos a estos factores humorales de la inflamación de la ELA. Se han realizado varios estudios con astrocitos primarios de modelos murinos de ELA, no solo en cachorros sino también en animales sintomáticos, ya sea en el cerebro o en la médula espinal 18,19,20,21. Esto también es cierto para los cultivos primarios microgliales, aunque en menor medida que los astrocitos y principalmente de regiones cerebrales en la etapa embrionaria^22,23,24.

Utilizamos imágenes de video de lapso de tiempo de Ca²⁺ en células en cultivo principalmente como un medio para seguir los transitorios intracelulares de este ion como un marcador fisiológico de excitotoxicidad. Así, mediante la caracterización biofísica de estos transitorios (amplitud, área bajo transitorio, tiempo de subida, frecuencia) el investigador puede obtener parámetros diagnósticos experimentales a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneración. Por lo tanto, esta técnica ofrece una ventaja de una evaluación fisiológica cuantitativa de IgG como biomarcadores de enfermedades. Existe una gran cantidad de literatura sobre el papel de las IgG y el Ca²⁺ en la inducción de la ELA. La mayoría de estos estudios se realizaron mediante la inducción de ELA mediante la inyección de IgG de pacientes en animales de experimentación 25,26,27,28,29^, que luego mostraron elevación intracelular de Ca ²⁺ y depósitos de IgG. Una línea de estudios exploró el efecto de las IgG de ELA en la sinapsis motora in vitro^30,31,32. En el contexto anterior, la técnica presentada aquí pone el foco en las células gliales como actores importantes en el mecanismo autónomo no celular de la ELA y cuantifica su potencial respuesta excitotóxica a las IgG como factores humorales de neuroinflamación. Este enfoque puede tener una aplicación más amplia en la prueba de otros factores humorales como sueros enteros, LCR o citoquinas en diferentes sistemas de cultivo celular y en modelos celulares de inflamación general.

Este documento describe cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar aún más estas células para estudiar la fisiopatología de la ELA con IgG derivada de sueros del paciente. Los protocolos se detallan para la carga de colorante de células cultivadas (Figura 1) y las grabaciones de cambios de Ca²⁺ en experimentos de imágenes de video de lapso de tiempo. Ejemplos de grabaciones de video mostrarán cómo reaccionan las células gliales a la IgG ALS en comparación con el ATP, este último activando los receptores de membrana purinérgica. Se muestra por primera vez un ejemplo de cómo los astrocitos aislados del cerebro de rata hSOD1^G93A ALS reaccionan con una respuesta de Ca 2+ más pronunciada a la IgG de ELA en comparación con los controles no transgénicos y cómo relacionar este proceso con las diferencias en la operación de almacenamiento de Ca²⁺. También se muestra un ejemplo de imágenes de calcio en células microgliales con un desafío agudo con ELA IgG, con solo una respuesta modesta de calcio intracelular.