大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化症研究中的应用

细胞培养技术在健康和疾病的细胞神经生理学不同领域取得了许多进展。特别是，从实验室动物的神经元组织中新鲜分离的原代细胞培养物使实验者能够仔细研究不同生化介质和生理设置中不同细胞的行为。使用不同的荧光生理指示剂（例如Ca²⁺敏感染料）与延时视频显微镜相结合，可以实时更好地了解细胞的生物物理和生化过程。

ALS是一种破坏性的神经退行性疾病，影响上运动神经元和下运动神经元¹。该病具有家族型的复杂发病机制，但主要是散发形式（90% 的病例）²。众所周知，非细胞自主机制有助于ALS病理生理学，主要是由于神经胶质细胞的重要作用³。ALS也被很好地描述为一种神经炎症性疾病，涉及体液和炎症的细胞因素。

免疫球蛋白G被广泛用作ALS和其他神经退行性疾病的分子标志物。研究该标志物的血清水平可以指示疾病^中神经炎症的存在和阶段4，⁵，6^，而其在脑脊液中的存在可以表明血^脑屏障的破坏7。IgG也被确定为ALS患者脊髓运动神经元中的沉积物⁷。然而，这种方法在IgG水平^与疾病分期和特征的相关性方面显示出一些不一致之处6。

从ALS患者血清中分离的IgG（ALS IgG）可以在幼稚星形胶质细胞中诱导钙反应⁸和神经元中的谷氨酸释放，这表明兴奋性毒性作用 – ALS病理学⁹的标志。然而，对hSOD1^G93A ALS大鼠模型（包含人SOD1突变的多个拷贝¹⁰）的研究表明，培养的神经胶质细胞11，组织¹²，13^，14或活体动物¹³中有许多氧化应激标志物。值得注意的是，从ALS大鼠模型培养的星形胶质细胞比来自非转基因同窝的星形胶质细胞更容易发生过氧化物诱导的氧化应激¹¹。

培养中的小胶质细胞以不太明显的方式受到ALS IgG的影响。也就是说，BV-2小胶质细胞系仅响应于4/11 ALS IgG患者样本的应用，显示出来自氧化应激荧光标记物的信号升高¹⁵。众所周知，小胶质细胞参与许多神经炎症病理，增加了ALS^16，17非细胞自主机制的氧化应激和晚期进展阶段。然而，ALS IgGs的数据表明，这些细胞可能不像星形胶质细胞那样对这些ALS炎症的体液因子有反应。已经对来自ALS小鼠模型的原代星形胶质细胞进行了几项研究，不仅在幼崽中，而且在有症状的动物中，无论是在大脑还是脊髓上¹⁸，¹⁹，^20，21。小胶质细胞原代培养也是如此，尽管程度低于星形胶质细胞，并且主要来自胚胎阶段的大脑区域²²，^23，24。

我们在培养的细胞上使用Ca²⁺的延时视频成像，主要作为跟踪该离子的细胞内瞬变作为兴奋性毒性的生理标志物的手段。因此，通过对这些瞬变（振幅、瞬态下面积、上升时间、频率）进行生物物理表征，研究人员可以从不同的神经变性细胞模型中获得实验诊断参数。因此，该技术提供了对IgG作为疾病生物标志物进行定量生理评估的优势。有大量关于IgG和Ca²⁺在诱导ALS中的作用的文献。这些研究中的大多数是通过将患者IgGs注射到实验动物^25，26，27，^28，29中诱导ALS进行的^，然后显示细胞内Ca ²⁺升高和IgG沉积。一系列研究探讨了ALS IgGs对体外运动突触的影响³⁰，^31，32。在上述背景下，这里介绍的技术将重点放在神经胶质细胞作为ALS非细胞自主机制的重要参与者上，并量化了它们对IgG的潜在兴奋毒性反应作为神经炎症的体液因子。这种方法在测试其他体液因子（如全血清、脑脊液或细胞因子）中可能具有更广泛的应用，这些因子在不同的细胞培养系统和一般炎症的细胞模型中。

本文描述了如何从Sprague Dawley大鼠的皮质制备神经胶质细胞，星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养物，以及如何进一步使用这些细胞研究患者血清来源的IgG的ALS病理生理学。详细介绍了培养细胞的染料上样（图1）和延时视频成像实验中Ca²⁺ 变化的记录方案。视频记录的例子将显示与ATP相比，神经胶质细胞对ALS IgG的反应，后者激活嘌呤能膜受体。首次展示了一个关于从hSOD1^G93A ALS大鼠大脑中分离的星形胶质细胞如何与非转基因对照相比对ALS IgG产生更显着的Ca²⁺ 反应的示例，以及如何将该过程与Ca^{2 +} 商店操作的差异联系起来。还显示了ALS IgG急性攻击的小胶质细胞中的钙成像示例，细胞内钙仅有适度反应。