げっ歯類の外科的緑内障に対する辺縁血管神経叢の全周焼灼
概要
このプロトコルの目的は、緑内障性神経変性の新しいモデルを特徴付けることです 辺縁血管神経叢の360°熱焼灼に基づいて、亜急性高眼圧症を誘発します。
Abstract
緑内障は、世界の失明原因の第2位であり、視神経と網膜神経節細胞(RGC)の変性に構造的損傷があり、眼から脳への視覚情報の伝達が遮断されることにより視覚機能障害を引き起こす不均一な眼疾患群です。眼圧の上昇は最も重要な危険因子です。したがって、高眼圧症のいくつかのモデルは、病気の原因と影響を調査するために、遺伝的または実験的アプローチのいずれかによってげっ歯類で開発されています。それらの中で、外科的侵襲性、不十分な機能評価、広範なトレーニングの必要性、網膜損傷の非常に変動の大きい拡張など、いくつかの制限が報告されています。本研究は、房水ドレナージの主要成分である辺縁血管神経叢の低温全円焼灼に基づく、げっ歯類に高眼圧症を誘発する単純で低コストかつ効率的な方法を特徴付ける。この新しいモデルは、進行性のRGCおよび視神経変性に関連する、技術的に簡単で非侵襲的で再現性のある亜急性高眼圧症と、電気生理学的および行動学的方法の両方による in vivo 機能研究を可能にする独自の術後の臨床回復率を提供します。
Introduction
医学文献では、緑内障は、網膜神経節細胞(RGC)、樹状突起、体細胞、および軸索の進行性変性を特徴とする視神経障害の不均一なグループとして理解されており、その結果、視神経の構造的カッピング(発掘)と視神経の機能低下が起こり、眼から脳への視覚情報の伝達を中断することにより、制御されていない症例で黒内障を引き起こします1.緑内障は現在、世界中で不可逆的な失明の最も一般的な原因であり、2040年には約1億1,180万人に達すると予測されており2、患者の生活の質(QOL)に深く影響し、重大な社会経済的懸念を引き起こしています3。
眼圧の上昇(IOP)は、緑内障の発症と進行にとって最も重要で唯一の修正可能な危険因子の1つです。複数のタイプの緑内障のうち、正常緊張緑内障(NTG)を除くすべての緑内障は、疾患の病歴のある時点でIOPの上昇に関連しています。眼圧を標的とし、疾患の進行を遅らせたり止めたりするための臨床的および外科的進歩にもかかわらず、患者は依然として緑内障のために視力を失います4,5。したがって、この疾患の複雑で多因子的な病態生理学を完全に理解することは、より効果的な治療法の開発、特にRGCに神経保護を提供するために不可欠です。
疾患のメカニズムを理解するためのさまざまな実験的アプローチの中で、高眼圧症(OHT)に基づく動物モデルは、ヒトの緑内障に最もよく似ています。げっ歯類モデルは、低コストで、取り扱いが容易で、遺伝子操作が可能で、寿命が短く、房水の産生や排液など、人間に匹敵する眼の解剖学的および生理学的特徴を示すため、特に有用です6,7,8,9,10,11,12,13 .現在使用されているモデルには、強膜上静脈への高張生理食塩水の注入後の線維柱帯の硬化症14、マイクロビーズ15または粘弾性物質のカメラ内注入16、渦静脈の焼灼17、アルゴンレーザー18、辺縁周囲縫合糸19による線維柱帯網膜の光凝固、および加齢性OHT(DBA/2Jマウス)のトランスジェニックモデルの使用が含まれます8.しかし、侵襲性、角膜の術後混濁、前眼部の破壊、広範な学習曲線、高価な機器、および術後IOPの変動は、現在のモデルに関連する報告された落とし穴のいくつかであり、OHTの代替モデルの開発は、これらの問題を克服するための要求となっています20,21,22。
本プロトコルは、げっ歯類の辺縁神経叢焼灼術(LPC)に基づいて、緑内障の代理としてOHTを誘発する新しい外科的処置を形式化します23。これは、簡単で再現性が高く、アクセスしやすく、非侵襲的なモデルであり、高効率でIOP上昇の変動性が低く、完全に臨床的に回復する割合が他に類を見ないため、各実験で使用される動物の数を減らしてin vivo で機能評価を行うことができます。手術技術は亜急性OHTを誘発し、数日でベースラインレベルに徐々に戻り、急性閉塞隅角緑内障で見られる高血圧発作をモデル化します。さらに、モデルにおける眼圧回復に続いて、緑内障性神経変性が持続し、これは、眼圧の適切な制御にもかかわらず、ヒト緑内障のいくつかの症例で発生するRGCの二次変性の将来の機構研究に有用である。
Protocol
すべての手順は、Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明に準拠して実施され、リオデジャネイロ連邦大学健康科学センターの科学実験における動物の使用に関する倫理委員会によって承認されました(プロトコル083/17)。本研究では、生後2〜3ヶ月、体重180〜320gのリスターフード付きラットを用いた。しかし、この手順は、さまざま?…
Representative Results
量的変数は、平均±平均の標準誤差(SEM)として表されます。OHT群と対照群の眼圧動態の比較(図1F)を除き、統計解析は二元配置ANOVAとそれに続くSidakの多重比較検定を用いて行った。p値<0.05は統計的に有意であると見なされました。 図1 は、全円輪姦焼灼術(LPC)モデルの外科的手順を示しており、360°の熱による辺縁血管の消失や?…
Discussion
辺縁神経叢焼灼術(LPC)は、結膜やほぞの解剖を必要としない、簡単にアクセスできる血管構造を標的にするという利点を備えた新しい海綿後モデルです17,28。脈絡膜静脈ドレナージの外科的障害に基づく有名なOHTモデルである渦静脈焼灼モデルとは異なり、静脈うっ血はLPCモデルでは、静脈静脈が房水流出の上流に位置するため、IOPの上昇に影響を?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、検査技師のホセを認めます。ニルソン・ドス・サントス、ダイアン・マンダリーノ・トーレス、ホセ・フランシスコ・ティブルシオ、ジルド・ブリト・デ・ソウザ、ルチアーノ・カヴァルカンテ・フェレイラ。この研究は、FAPERJ、CNPq、およびCAPESから資金提供を受けました。
Materials
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | – | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | – | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | – | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | – | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | – | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | – | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | – | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
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