概要

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Published: February 15, 2022
doi:

概要

O objetivo deste protocolo é caracterizar um novo modelo de neurodegeneração glaucomatosa baseado na cauterização térmica 360° do plexo vascular limbal, induzindo hipertensão ocular subaguda.

Abstract

O glaucoma, segunda causa de cegueira no mundo, é um grupo heterogêneo de doenças oculares caracterizadas por danos estruturais ao nervo óptico e degeneração das células ganglionares da retina (CGR), resultando em disfunção visual pela interrupção da transmissão de informações visuais do olho para o cérebro. A pressão intraocular elevada é o fator de risco mais importante; Assim, vários modelos de hipertensão ocular têm sido desenvolvidos em roedores por abordagens genéticas ou experimentais para investigar as causas e efeitos da doença. Dentre essas, algumas limitações têm sido relatadas, como invasividade cirúrgica, avaliação funcional inadequada, exigência de treinamento extensivo e extensão altamente variável do dano retiniano. O presente trabalho caracteriza um método simples, de baixo custo e eficiente para induzir hipertensão ocular em roedores, baseado na cauterização em círculo completo do plexo limbal a baixa temperatura, um dos principais componentes da drenagem aquosa do humor. O novo modelo proporciona uma hipertensão ocular subaguda tecnicamente fácil, não invasiva e reprodutível, associada à degeneração progressiva do CGR e do nervo óptico, e uma taxa de recuperação clínica pós-operatória única que permite estudos funcionais in vivo por métodos eletrofisiológicos e comportamentais.

Introduction

A literatura médica entende o glaucoma como um grupo heterogêneo de neuropatias ópticas caracterizadas por degeneração progressiva das células ganglionares da retina (CGRs), dendritos, soma e axônios, resultando em escavação estrutural (escavação) do disco óptico e deterioração funcional do nervo óptico, levando à amaurose em casos não controlados pela interrupção da transmissão de informações visuais do olho para océrebro1. Atualmente, o glaucoma é a causa mais comum de cegueira irreversível em todo o mundo, com previsão de atingir aproximadamente 111,8 milhões de pessoas em 20402, afetando profundamente a qualidade de vida (QV) dos pacientes e levando a importantes preocupações socioeconômicas3.

A pressão intraocular (PIO) elevada é um dos mais importantes e o único fator de risco modificável para o desenvolvimento e progressão do glaucoma. Dentre os múltiplos tipos de glaucoma, todos, exceto o glaucoma de tensão normal (GNT), estão associados à PIO elevada em algum momento da história clínica da doença. Apesar dos notáveis avanços clínicos e cirúrgicos para atingir a PIO e retardar ou interromper a progressão da doença, os pacientes ainda perdem a visão devido ao glaucoma 4,5. Portanto, o conhecimento aprofundado da fisiopatologia complexa e multifatorial dessa doença é imperativo para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes, especialmente para fornecer neuroproteção aos CGRs.

Entre uma variedade de abordagens experimentais para a compreensão dos mecanismos da doença, os modelos animais baseados em hipertensão ocular (OHT) mais se assemelham ao glaucoma humano. Os modelos de roedores são particularmente úteis por serem de baixo custo, fácil manuseio, manipulação genética, vida útil curta e características anatômicas e fisiológicas oculares comparáveis aos humanos, como produção e drenagem do humor aquoso 6,7,8,9,10,11,12,13 . Os modelos atualmente utilizados incluem esclerose da malha trabecular após injeção de solução salina hipertônica em veias episclerais 14, injeção intracameral de microesferas15 ou substâncias viscoelásticas 16, cauterização de veias vórtices 17, fotocoagulação da tela trabecular com laser de argônio18, sutura circunlimbal 19 e uso de um modelo transgênico de OHT relacionada à idade (camundongos DBA/2J)8. No entanto, invasividade, opacificação pós-operatória da córnea, ruptura do segmento anterior, curvas de aprendizado extensas, equipamentos caros e PIO pós-operatória altamente variável estão entre algumas das armadilhas relatadas associadas aos modelos atuais, tornando o desenvolvimento de um modelo alternativo de ESB uma demanda para superar esses problemas20,21,22.

O presente protocolo formaliza um novo procedimento cirúrgico para induzir OHT como substituto do glaucoma, baseado na cauterização do plexo limbal (LPC) emroedores23. Trata-se de um modelo fácil, reprodutível, acessível e não invasivo, que proporciona alta eficiência e baixa variabilidade de elevação da PIO, associado a uma taxa excepcionalmente alta de recuperação clínica completa, proporcionando avaliação funcional in vivo em um número reduzido de animais utilizados em cada experimento. A técnica cirúrgica induz OHT subaguda com retorno gradual aos níveis basais em poucos dias, o que modela o ataque hipertensivo observado no glaucoma agudo de ângulo fechado. Além disso, a recuperação da PIO no modelo é seguida por neurodegeneração glaucomatosa contínua, o que é útil para futuros estudos mecanísticos da degeneração secundária dos CGRs, que ocorre em vários casos de glaucoma humano apesar do controle adequado da PIO.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) e aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Experimentação Científica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro (protocolo 083/17). No presente trabalho, foram utilizados ratos Lister Hooded, de ambos os sexos, com idade entre 2-3 meses e peso de 180-320 g. No entanto, o procedimento pode…

Representative Results

As variáveis quantitativas foram expressas como média ± erro padrão da média (EPM). Com exceção da comparação da dinâmica da PIO entre os grupos ESB e controle (Figura 1F), a análise estatística foi realizada por meio de ANOVA two-way seguida do teste de comparações múltiplas de Sidak. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A Figura 1 ilustra os passos cirúrgicos do modelo de cauterizaçã…

Discussion

A cauterização do plexo limbal (LPC) é um novo modelo pós-trabecular com a vantagem de ter como alvo estruturas vasculares de fácil acesso, não necessitando de dissecção conjuntival outenonal 17,28. Diferentemente do modelo de cauterização de veias vórtices, um renomado modelo de OHT baseado no comprometimento cirúrgico da drenagem venosa coroide, não se espera que a congestão venosa influencie a elevação da PIO no modelo LPC, uma vez que as veias…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos nossos técnicos de laboratório José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza e Luciano Cavalcante Ferreira. Pesquisa financiada pela FAPERJ, CNPq e CAPES.

Materials

Acetone Isofar 201 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography Hansol Medical Co Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon Novartis Biociências S/A MS-1.0068.1087 Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride Vetec 560 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx Bovie Medical Corporation AA00 Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin Syntec do Brasil Ltda 000200-3-000003 Ketamine hydrochloride 10%
DAKO Dako North America S3023 Antifade mounting medium
DAPI Thermo Fisher Scientific 28718-90-3 diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0487 Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin Polysciences, Inc. Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16110 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-8042140002 Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab Icare Finland Oy TV02 (model number) Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A31570 Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches Samsung Electronics Co. Ltd. S23B550 Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta Carl Zeiss Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0489 Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K Nihon Kohden Corporation System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a MilliporeSigma MAB-1585 Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33 Nihon Kohden Corporation Software for electroretinogram signal processing
Optomotry CerebralMechanics System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19100 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide Electron Microscopy Sciences 20150 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography Chalgren Enterprises 110-63 Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 12300 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-1.0497.1287 Prednisolone acetate 0.12%
Terolac Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0497.1286 Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina Laboratórios Pfizer Ltda MS-1.0216.0024 Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL Reichert Technologies 230635 Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3 Thermo Fisher Scientific T3605 Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 Non-ionic surfactant
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin Syntec do Brasil Ltda 7899 Xylazine hydrochloride 2%
Carl Zeiss Stereo microscope for surgery and retinal dissection

参考文献

  1. Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
  2. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  3. Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
  4. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  5. Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
  6. Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
  7. Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
  8. John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
  9. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
  10. Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
  11. vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
  12. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Aqueous humor dynamics in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).
  13. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal microvasculature of the rat eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).
  14. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  15. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
  16. Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
  17. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
  18. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
  19. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
  20. Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
  21. Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
  22. Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
  23. Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
  24. vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
  25. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  26. Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
  27. Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
  28. Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
  29. Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , 139-157 (2008).
  30. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).

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記事を引用
Lani-Louzada, R., Abreu, C. A., Araújo, V. G., Dias, M. S., Petrs-Silva, H., Linden, R. Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents. J. Vis. Exp. (180), e63442, doi:10.3791/63442 (2022).

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