概要

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

Published: February 15, 2022
doi:

概要

מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין מודל חדשני של ניוון עצבי גלאוקומטי המבוסס על צריבה תרמית של 360° של מקלעת כלי הדם הלימבלית, הגורמת ליתר לחץ דם עיני תת-חריף.

Abstract

גלאוקומה, הגורם השני המוביל לעיוורון בעולם, היא קבוצה הטרוגנית של הפרעות עיניות המאופיינות בנזק מבני לעצב הראייה ולניוון תאי גנגליון רשתית (RGC), וכתוצאה מכך תפקוד לקוי של הראייה על ידי הפרעה בהעברת מידע חזותי מהעין למוח. לחץ תוך עיני מוגבר הוא גורם הסיכון החשוב ביותר; לפיכך, מספר מודלים של יתר לחץ דם עיני פותחו במכרסמים על ידי גישות גנטיות או ניסיוניות כדי לחקור את הגורמים וההשפעות של המחלה. בין אלה, דווחו מגבלות מסוימות כגון פולשניות כירורגית, הערכה תפקודית לא מספקת, דרישה להכשרה מקיפה והרחבה משתנה מאוד של נזק לרשתית. העבודה הנוכחית מאפיינת שיטה פשוטה, זולה ויעילה לגרימת יתר לחץ דם עיני במכרסמים, המבוססת על צריבה בטמפרטורה נמוכה ובמעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית, מרכיב מרכזי בניקוז הומור מימי. המודל החדש מספק יתר לחץ דם עיני תת-חריף קל מבחינה טכנית, לא פולשני וניתן לשחזור, הקשור ל-RGC מתקדם וניוון עצבי הראייה, ושיעור התאוששות קליני ייחודי לאחר הניתוח המאפשר מחקרים פונקציונליים in vivo בשיטות אלקטרופיזיולוגיות והתנהגותיות כאחד.

Introduction

הספרות הרפואית מבינה את הגלאוקומה כקבוצה הטרוגנית של נוירופתיות אופטיות המאופיינות בניוון מתקדם של תאי גנגליון רשתית (RGCs), דנדריטים, סומא ואקסונים, וכתוצאה מכך כוסות רוח מבניות (חפירה) של דיסק הראייה והידרדרות תפקודית של עצב הראייה, מה שמוביל לאמאורוזיס במקרים בלתי מבוקרים על ידי הפרעה להעברת מידע חזותי מהעין למוח1. גלאוקומה היא כיום הגורם השכיח ביותר לעיוורון בלתי הפיך ברחבי העולם, צפויה להגיע לכ -111.8 מיליון אנשים בשנת 20402, ובכך להשפיע עמוקות על איכות החיים של החולים (QoL) ולהוביל לדאגות סוציו-אקונומיות משמעותיות3.

לחץ תוך עיני מוגבר (IOP) הוא אחד מגורמי הסיכון החשובים ביותר והיחיד הניתן לשינוי להתפתחות והתקדמות של גלאוקומה. בין סוגים מרובים של גלאוקומה, כולם, למעט גלאוקומה מתח נורמלי (NTG), קשורים IOP גבוה בזמן כלשהו בהיסטוריה הקלינית של המחלה. למרות התקדמות קלינית וכירורגית יוצאת דופן כדי להתמקד IOP ולהאט או לעצור את התקדמות המחלה, חולים עדיין לאבד את הראייה עקב גלאוקומה 4,5. לכן, הבנה מעמיקה של הפתופיזיולוגיה המורכבת והרב-תכליתית של מחלה זו היא הכרחית לפיתוח טיפולים יעילים יותר, במיוחד כדי לספק הגנה עצבית ל- RGCs.

בין מגוון גישות ניסיוניות להבנת מנגנוני המחלה, מודלים של בעלי חיים המבוססים על יתר לחץ דם עיני (OHT) דומים ביותר לגלאוקומה אנושית. מודלים של מכרסמים שימושיים במיוחד מכיוון שהם זולים, קלים לטיפול, ניתנים למניפולציה גנטית, בעלי תוחלת חיים קצרה, ומציגים תכונות אנטומיות ופיזיולוגיות עיניות דומות לבני אדם, כגון ייצור הומור מימי וניקוז 6,7,8,9,10,11,12,13 . המודלים המשמשים כיום כוללים טרשת נפוצה של הרשת הטרבקולרית בעקבות הזרקת מי מלח היפרטוניים לורידים אפיסקרליים14, הזרקה תוך-מצלמה של מיקרו-כדוריות15 או חומרים ויסקו-אלסטיים 16, צריבה של וורידי מערבולת 17, פוטוקואגולציה של הרשת הטרבקולרית עם לייזר ארגון 18, תפר היקפי 19, ושימוש במודל מהונדס של עכברי OHT (DBA/2J) הקשורים לגיל)8. עם זאת, פולשניות, אופסיפיקציה לאחר הניתוח של הקרנית, הפרעה במקטע הקדמי, עקומות למידה נרחבות, ציוד יקר ו- IOPs משתנים מאוד לאחר הניתוח, הם בין המלכודות המדווחות הקשורות למודלים הנוכחיים, מה שהופך את הפיתוח של מודל חלופי של OHT לדרישה להתגבר על בעיות אלה20,21,22.

הפרוטוקול הנוכחי ממסד הליך כירורגי חדשני להשראת OHT כפרוקסי לגלאוקומה, המבוסס על צריבת מקלעת לימבל (LPC) במכרסמים23. זהו מודל קל, ניתן לשחזור, נגיש ולא פולשני המספק יעילות גבוהה ושונות נמוכה של גובה IOP, הקשורים לשיעור גבוה באופן ייחודי של התאוששות קלינית מלאה, ולכן מספק הערכה תפקודית in vivo במספר מופחת של בעלי חיים המשמשים בכל ניסוי. טכניקת הניתוח גורמת ל- OHT תת-חריף עם חזרה הדרגתית לרמות הבסיס תוך מספר ימים, המדמה את התקף יתר לחץ דם שנראה בגלאוקומה חריפה של סגירת זווית. יתר על כן, התאוששות IOP במודל ואחריו ניוון עצבי גלאוקומטי מתמשך, אשר שימושי עבור מחקרים מכניסטיים עתידיים של ניוון משני של RGCs, אשר מתרחשת במספר מקרים של גלאוקומה אנושית למרות שליטה נאותה של IOP.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להצהרה לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה של האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO) ואושרו על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים בניסויים מדעיים מהמרכז למדעי הבריאות, האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז’ניירו (פרוטוקול 083/17). בעבודה הנוכחית נעשה שימוש בחולדות ליסטר ברדס משני ה?…

Representative Results

המשתנים הכמותיים מבוטאים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). מלבד השוואת דינמיקת IOP בין OHT וקבוצות ביקורת (איור 1F), ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של סידאק. ערך p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. איור 1 מדגים שלבים כירו?…

Discussion

צריבת מקלעת לימבל (LPC) הוא מודל פוסט-טרבקולרי חדשני עם היתרון שהוא מכוון למבני כלי דם נגישים בקלות שאינם דורשים דיסקציה של לחמית או טנון17,28. בשונה ממודל הצריבה של וורידי מערבולת, מודל OHT ידוע המבוסס על הפגיעה הניתוחית בניקוז ורידי כורואידים, גודש ורידי לא צפו?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים בטכנאי המעבדה שלנו חוסה; נילסון דוס סנטוס, דיאן מנדרינו טורס, חוסה פרנסיסקו טיבורסיו, גילדו בריטו דה סוזה ולוצ’יאנו קבלקנטה פריירה. מחקר זה מומן על ידי FAPERJ, CNPq ו- CAPES.

Materials

Acetone Isofar 201 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography Hansol Medical Co Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon Novartis Biociências S/A MS-1.0068.1087 Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride Vetec 560 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx Bovie Medical Corporation AA00 Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin Syntec do Brasil Ltda 000200-3-000003 Ketamine hydrochloride 10%
DAKO Dako North America S3023 Antifade mounting medium
DAPI Thermo Fisher Scientific 28718-90-3 diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0487 Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin Polysciences, Inc. Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16110 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-8042140002 Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab Icare Finland Oy TV02 (model number) Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A31570 Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches Samsung Electronics Co. Ltd. S23B550 Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta Carl Zeiss Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0298.0489 Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K Nihon Kohden Corporation System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a MilliporeSigma MAB-1585 Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33 Nihon Kohden Corporation Software for electroretinogram signal processing
Optomotry CerebralMechanics System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19100 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide Electron Microscopy Sciences 20150 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography Chalgren Enterprises 110-63 Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 12300 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD União Química Farmacêutica Nacional S/A MS-1.0497.1287 Prednisolone acetate 0.12%
Terolac Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda MS-1.0497.1286 Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina Laboratórios Pfizer Ltda MS-1.0216.0024 Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL Reichert Technologies 230635 Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3 Thermo Fisher Scientific T3605 Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 Non-ionic surfactant
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin Syntec do Brasil Ltda 7899 Xylazine hydrochloride 2%
Carl Zeiss Stereo microscope for surgery and retinal dissection

参考文献

  1. Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
  2. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  3. Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
  4. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  5. Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
  6. Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
  7. Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
  8. John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
  9. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
  10. Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
  11. vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
  12. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Aqueous humor dynamics in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).
  13. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal microvasculature of the rat eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).
  14. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  15. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
  16. Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
  17. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
  18. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
  19. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
  20. Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
  21. Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
  22. Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
  23. Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
  24. vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
  25. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  26. Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
  27. Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
  28. Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
  29. Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , 139-157 (2008).
  30. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).

Play Video

記事を引用
Lani-Louzada, R., Abreu, C. A., Araújo, V. G., Dias, M. S., Petrs-Silva, H., Linden, R. Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents. J. Vis. Exp. (180), e63442, doi:10.3791/63442 (2022).

View Video