מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין מודל חדשני של ניוון עצבי גלאוקומטי המבוסס על צריבה תרמית של 360° של מקלעת כלי הדם הלימבלית, הגורמת ליתר לחץ דם עיני תת-חריף.
גלאוקומה, הגורם השני המוביל לעיוורון בעולם, היא קבוצה הטרוגנית של הפרעות עיניות המאופיינות בנזק מבני לעצב הראייה ולניוון תאי גנגליון רשתית (RGC), וכתוצאה מכך תפקוד לקוי של הראייה על ידי הפרעה בהעברת מידע חזותי מהעין למוח. לחץ תוך עיני מוגבר הוא גורם הסיכון החשוב ביותר; לפיכך, מספר מודלים של יתר לחץ דם עיני פותחו במכרסמים על ידי גישות גנטיות או ניסיוניות כדי לחקור את הגורמים וההשפעות של המחלה. בין אלה, דווחו מגבלות מסוימות כגון פולשניות כירורגית, הערכה תפקודית לא מספקת, דרישה להכשרה מקיפה והרחבה משתנה מאוד של נזק לרשתית. העבודה הנוכחית מאפיינת שיטה פשוטה, זולה ויעילה לגרימת יתר לחץ דם עיני במכרסמים, המבוססת על צריבה בטמפרטורה נמוכה ובמעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית, מרכיב מרכזי בניקוז הומור מימי. המודל החדש מספק יתר לחץ דם עיני תת-חריף קל מבחינה טכנית, לא פולשני וניתן לשחזור, הקשור ל-RGC מתקדם וניוון עצבי הראייה, ושיעור התאוששות קליני ייחודי לאחר הניתוח המאפשר מחקרים פונקציונליים in vivo בשיטות אלקטרופיזיולוגיות והתנהגותיות כאחד.
הספרות הרפואית מבינה את הגלאוקומה כקבוצה הטרוגנית של נוירופתיות אופטיות המאופיינות בניוון מתקדם של תאי גנגליון רשתית (RGCs), דנדריטים, סומא ואקסונים, וכתוצאה מכך כוסות רוח מבניות (חפירה) של דיסק הראייה והידרדרות תפקודית של עצב הראייה, מה שמוביל לאמאורוזיס במקרים בלתי מבוקרים על ידי הפרעה להעברת מידע חזותי מהעין למוח1. גלאוקומה היא כיום הגורם השכיח ביותר לעיוורון בלתי הפיך ברחבי העולם, צפויה להגיע לכ -111.8 מיליון אנשים בשנת 20402, ובכך להשפיע עמוקות על איכות החיים של החולים (QoL) ולהוביל לדאגות סוציו-אקונומיות משמעותיות3.
לחץ תוך עיני מוגבר (IOP) הוא אחד מגורמי הסיכון החשובים ביותר והיחיד הניתן לשינוי להתפתחות והתקדמות של גלאוקומה. בין סוגים מרובים של גלאוקומה, כולם, למעט גלאוקומה מתח נורמלי (NTG), קשורים IOP גבוה בזמן כלשהו בהיסטוריה הקלינית של המחלה. למרות התקדמות קלינית וכירורגית יוצאת דופן כדי להתמקד IOP ולהאט או לעצור את התקדמות המחלה, חולים עדיין לאבד את הראייה עקב גלאוקומה 4,5. לכן, הבנה מעמיקה של הפתופיזיולוגיה המורכבת והרב-תכליתית של מחלה זו היא הכרחית לפיתוח טיפולים יעילים יותר, במיוחד כדי לספק הגנה עצבית ל- RGCs.
בין מגוון גישות ניסיוניות להבנת מנגנוני המחלה, מודלים של בעלי חיים המבוססים על יתר לחץ דם עיני (OHT) דומים ביותר לגלאוקומה אנושית. מודלים של מכרסמים שימושיים במיוחד מכיוון שהם זולים, קלים לטיפול, ניתנים למניפולציה גנטית, בעלי תוחלת חיים קצרה, ומציגים תכונות אנטומיות ופיזיולוגיות עיניות דומות לבני אדם, כגון ייצור הומור מימי וניקוז 6,7,8,9,10,11,12,13 . המודלים המשמשים כיום כוללים טרשת נפוצה של הרשת הטרבקולרית בעקבות הזרקת מי מלח היפרטוניים לורידים אפיסקרליים14, הזרקה תוך-מצלמה של מיקרו-כדוריות15 או חומרים ויסקו-אלסטיים 16, צריבה של וורידי מערבולת 17, פוטוקואגולציה של הרשת הטרבקולרית עם לייזר ארגון 18, תפר היקפי 19, ושימוש במודל מהונדס של עכברי OHT (DBA/2J) הקשורים לגיל)8. עם זאת, פולשניות, אופסיפיקציה לאחר הניתוח של הקרנית, הפרעה במקטע הקדמי, עקומות למידה נרחבות, ציוד יקר ו- IOPs משתנים מאוד לאחר הניתוח, הם בין המלכודות המדווחות הקשורות למודלים הנוכחיים, מה שהופך את הפיתוח של מודל חלופי של OHT לדרישה להתגבר על בעיות אלה20,21,22.
הפרוטוקול הנוכחי ממסד הליך כירורגי חדשני להשראת OHT כפרוקסי לגלאוקומה, המבוסס על צריבת מקלעת לימבל (LPC) במכרסמים23. זהו מודל קל, ניתן לשחזור, נגיש ולא פולשני המספק יעילות גבוהה ושונות נמוכה של גובה IOP, הקשורים לשיעור גבוה באופן ייחודי של התאוששות קלינית מלאה, ולכן מספק הערכה תפקודית in vivo במספר מופחת של בעלי חיים המשמשים בכל ניסוי. טכניקת הניתוח גורמת ל- OHT תת-חריף עם חזרה הדרגתית לרמות הבסיס תוך מספר ימים, המדמה את התקף יתר לחץ דם שנראה בגלאוקומה חריפה של סגירת זווית. יתר על כן, התאוששות IOP במודל ואחריו ניוון עצבי גלאוקומטי מתמשך, אשר שימושי עבור מחקרים מכניסטיים עתידיים של ניוון משני של RGCs, אשר מתרחשת במספר מקרים של גלאוקומה אנושית למרות שליטה נאותה של IOP.
צריבת מקלעת לימבל (LPC) הוא מודל פוסט-טרבקולרי חדשני עם היתרון שהוא מכוון למבני כלי דם נגישים בקלות שאינם דורשים דיסקציה של לחמית או טנון17,28. בשונה ממודל הצריבה של וורידי מערבולת, מודל OHT ידוע המבוסס על הפגיעה הניתוחית בניקוז ורידי כורואידים, גודש ורידי לא צפו?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים בטכנאי המעבדה שלנו חוסה; נילסון דוס סנטוס, דיאן מנדרינו טורס, חוסה פרנסיסקו טיבורסיו, גילדו בריטו דה סוזה ולוצ’יאנו קבלקנטה פריירה. מחקר זה מומן על ידי FAPERJ, CNPq ו- CAPES.
Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | – | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
EPON Resin | Polysciences, Inc. | – | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA – Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA – Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 – 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
LSM 510 Meta | Carl Zeiss | – | Confocal epifluorescence microscope |
Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | – | System for electroretinogram recording |
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | – | Software for electroretinogram signal processing |
Optomotry | CerebralMechanics | – | System for optomotor response analysis |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
Carl Zeiss | – | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |