量化诱导剂梯度板上细菌表面聚集运动
概要
在这里，我们描述了使用诱导剂梯度板来评估细菌聚集运动，同时获得多种浓度响应。
Abstract
细菌聚集运动是一种常见的微生物表型，细菌群落用它来在半固体表面上迁移。在诱导聚集运动的研究中，诱导剂的特定浓度可能无法报告在最佳浓度范围内发生的事件，以引起物种的所需反应。含有多种浓度的半固体板通常用于研究诱导剂浓度范围内的反应。然而，由于不均匀的凝固时间，单独的半固体板会增加每个板内介质粘度和水分含量的变化。
本文描述了一种在单个梯度板上同时测试表面聚集运动的一步法，其中等距排列的测试孔允许同时采集多重度响应。在目前的工作中，评估了 大肠 杆菌K12和 铜绿假单胞菌 PAO1的表面聚集，以响应白藜芦醇和阿拉伯糖等诱导剂的浓度梯度。定期使用成像系统对群体形态进行成像，以捕获整个表面集群过程。
使用ImageJ软件获取了群体形态的定量测量，提供了群体区域的可分析信息。本文提出了一种简单的梯度群板方法，该方法提供了诱导剂对表面聚集的影响的定性和定量信息，可以扩展到研究其他诱导剂对更广泛的运动细菌物种的影响。
Introduction
细菌聚集运动是指细菌细胞在物质表面的集体迁移。除了在实验室中专门制备的半固体琼脂平板1外，在一些软基质上也观察到这种表型，例如动物组织2，水合表面3和植物根4。虽然半固体表面被认为是细菌聚集的基本条件之一，但一些物种也需要富含能量的培养基来支持它们的聚集运动5。鞭毛旋转为游泳和聚集运动提供动力 – 游泳描述了液体环境中的单细胞运动，而聚集是微生物种群在半固体表面上的同步运动。
底物粘度影响细菌运动;对致病微生物（如 幽门螺杆菌）的研究表明，病原体的运动性根据粘蛋白层粘度而变化，这受到人类宿主中环境酸化的影响6。为了复制这些环境，早期使用琼脂浓度高于0.3%（w / v）的研究限制了细菌游泳运动，以逐渐转变为表面聚集。使用高于1%（w / v）的琼脂浓度可以防止许多物种的聚集运动7。在表面上形成的蚁群模式是多种多样的，包括无特征的垫子8，牛眼9，树突10和涡旋11。
虽然这些模式的相关性尚不清楚，但这些模式似乎取决于环境和化学线索12。环境线索涵盖不同的方面，包括温度、盐度、光照和pH值，而化学线索包括微生物群体感应分子、生化副产物和营养物质的存在。自动诱导群体传感信号分子，如AHL（N-己酰-L高丝氨酸内酯）可以通过调节表面活性剂的产生来影响表面聚集13，14。白藜芦醇是一种植物抗毒素化合物，可以限制细菌聚集的运动15.
本文研究了白藜芦醇梯度浓度对野生型 大肠 杆菌K12菌株的影响，并研究了工程 大肠 杆菌K12-YdeH和 铜绿假单胞菌 PAO1-YdeH物种的阿拉伯糖诱导群运动。阿拉伯糖通过 araBAD 启动子诱导YdeH酶的产生，导致细胞c-di-GMP扰动并影响细菌群运动16，17。使用阿拉伯糖梯度群板与 大肠杆菌 K12-YdeH和 铜绿假单胞 菌PAO1-YdeH菌株研究这种诱导的群体行为。
梯度群板通过连续固化双层介质制备（图1B）。底层包括与诱导剂一起加入的培养基，倒在支撑的培养皿的一侧。在底层固化后，培养皿返回到平坦的表面，其中含有没有诱导剂的介质的上层从板的另一侧加入。在群板完全固化后，通过按照固定布局在群板上钻孔（图1C）或通过在介质固化过程中使用包含销子的板盖的3D打印模型印印孔来产生等距排列的保持井（补充图S1）。凝胶成像系统用于捕获不同时间点的聚集形态（图2）。使用ImageJ软件分析表面群（补充图S2）提供了表面聚集过程的定量结果（图3）。
因此，我们提出了一种简单的方法来测试诱导剂浓度范围内的表面聚集运动。该方法可用于通过将诱导剂混合到底层培养基中来测试其他诱导剂的多种浓度反应，并且可以应用于其他活动物种（例如， 枯草芽孢杆菌， 肠沙门氏菌， 奇异变形杆菌， 肠溶性耶尔森菌）。这种方法可以为筛选单一化学诱导剂提供可靠的定性和定量结果，并且可以使用单独的板来评估更多的化学诱导剂。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究半固体梯度板上细菌聚集的运动可能是一项具有挑战性的任务18，19，20，因为它涉及多种因素，如底物粘度，湿度和介质组分。在这些因素中，琼脂浓度在确定微生物恢复到游泳或聚集运动方面起着决定性作用。随着琼脂浓度从0.3%（w/ v）增加到1%（w / v），细菌游泳运动将受到限制并逐渐转变为表面聚集，高于1%（w / v）?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该技术的开发得到了科技部国家重点研发计划（2018YF0902604）、国家自然科学基金国际青年科学家研究基金会（22050410270）和深圳先进技术研究院对外资金（DWKF20190001）的资助。我们衷心感谢陈心怡小姐在校对文件和实验室管理方面的帮助。
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
参考文献
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
