2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

糖尿病は、世界中の何百万人もの人々に影響を与える複雑な代謝障害です。インスリンの補給は、糖尿病の唯一の治療選択肢と考えられています。より進行した症例は、死体膵臓全体または膵島のいずれかの移植によって達成されるベータ細胞補充療法で治療されます^1,2。免疫抑制剤の継続的な必要性に加えて、組織の入手可能性と質の制限、移植手順の侵襲性など、移植療法を取り巻くいくつかの問題。これには、ベータ細胞補充療法のための新規かつ代替的な選択肢を発見する必要性が必要です^2,3。ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、最近、ヒト膵臓の生物学を理解するための有望なツールとして、また移植治療のための非網羅的で潜在的によりパーソナライズされた供給源として浮上しています^4,5,6,7。ヒト胚性幹細胞(hESC)やヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)などのhPSCは、自己複製能力が高く、あらゆる組織型の人体を生じさせます。hESCは胚の内部細胞塊に由来し、hiPS細胞は任意の体細胞から再プログラムされます^4,8。

指向性分化プロトコルは、hPSCから膵臓ベータ細胞を生成するように最適化されており、hPSCを膵臓発生段階までinvitroで順次指示します。これらのプロトコルは、hPSC由来の膵島オルガノイドを生成します。それらはその中の膵臓ベータ細胞の割合を増加させることで大幅に改善されましたが、プロトコルの効率は非常に変動します。NKX6.1+/インスリン+またはC-ペプチド+細胞の~40%以上に増加しない⁵、⁹、¹⁰、11、^12、13。しかしながら、生成されたベータ細胞は、それらの転写および代謝プロファイルならびにグルコース^に対するそれらの応答の点で、成体ヒトベータ細胞と完全に同一ではない^4,5,14。hPSC由来のベータ細胞は、成体ヒト膵島と比較して、PCSK2、PAX6、UCN3、MAFA、G6PC2、およびKCNK3などの主要なベータ細胞マーカーの遺伝子発現を欠いています⁵。さらに、hPSC由来のベータ細胞は、グルコースに応答してカルシウムシグナル伝達を低下させています。それらは、グルコースレベルの上昇に応答して適切な量のインスリンを分泌しない共生成多ホルモン細胞で汚染されています⁵。一方、膵島の前駆体であるhPSC由来の膵臓前駆細胞は、ベータ細胞と比較してin vitroでより効率的に生成でき、in vivoに移植すると、機能的なインスリン分泌ベータ細胞に成熟する可能性があります^15,16。臨床試験は現在、T1D被験者における移植時の安全性と有効性を実証することに焦点を当てています。

特に、同じ膵臓前駆細胞内での転写因子PDX1(膵臓および十二指腸ホメオボックス1)およびNKX6.1(NKX6ホメオボックス1)の発現は、ベータ細胞^系譜5へのコミットメントにとって非常に重要です。NKX6.1を発現しない膵臓前駆細胞は、多ホルモン性内分泌細胞または非機能性ベータ細胞を生じさせる^17,18。したがって、膵臓前駆細胞期におけるPDX1とNKX6.1の高い共発現は、最終的に多数の機能的ベータ細胞を生成するために不可欠である。研究によると、胚様体または3D培養は、分化細胞が凝集している膵臓前駆細胞のPDX1およびNKX6.1を増強し、PDX1 + / NKX6.1 +集団の40%〜80%の間で変動することが示されています^12,19。しかし、浮遊培養と比較して、2D分化培養は、複数の細胞株への適用において、より費用効果が高く、実現可能で、便利です⁵。我々は最近、単層分化培養により、PDX1+/NKX6.1+を共発現するhPSC由来の膵臓前駆細胞を最大90%以上生成することを示しました^20,21,22。報告された方法は、生成された膵臓前駆細胞に高い複製能力を与え、肝系統²¹などの代替運命仕様を防止しました。したがって、本明細書において、このプロトコルは、PDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓ベータ細胞前駆体へのhPSCの分化のための非常に効率的な方法を実証する。この方法は、hPSC由来の内胚葉を解離して細胞密度を操作する技術を利用し、その後、FGFとレチノイドのシグナル伝達を拡張し、ヘッジホッグを阻害してPDX1とNKX6.1の共発現を促進します(図1)。この方法は、移植治療および疾患モデリングのためのhPSC由来膵臓ベータ細胞前駆体のスケーラブルな生成を促進することができる。