Síntese de Masarimicina, um inibidor de pequenas moléculas do crescimento bacteriano gram-positivo

Peptidoglycan (PG) é um polímero em forma de malha que delineia a forma e a estrutura das células em ambas as bactérias Gram-positivas e^{Gram-negativas 1,2}. Este heteropolímero é uma matriz de açúcares aminosatrados intercides por peptídeos curtos ^3,4,5,6 com uma espinha dorsal composta de resíduos de β N-acetilglucosamina alternada (GlcNAc) e ácido n-acetilmuramic (MurNAc) (Figura 1)¹. Anexado ao c-3 lactyl moiety de MurNAc é o peptídeo de haste. O metabolismo de PG envolve um sistema bem coordenado de enzimas biossintéticas e degradativas para incorporar novo material na parede^{celular 7,8}. A degradação de PG é realizada por enzimas coletivamente referidas como autolysinas⁹ e ainda classificadas com base na especificidade do vínculo rachado. As autolysinas participam de muitos processos celulares, incluindo crescimento celular, divisão celular, motilidade, maturação de PG, quimiotáxi, secreção de proteínas, competência genética, diferenciação e patogenicidade^10,11. Desvendar as funções biológicas específicas das autolysinas individuais pode ser assustador, devido, em parte, à redundância funcional. No entanto, os recentes estudos biofísicos 8,12,13 e computacionais¹² forneceram novas informações sobre seus papéis no metabolismo PG. Além disso, relatórios recentes forneceram mais informações sobre a síntese¹⁴ e 15,16,17 passos mediados por membrana no metabolismo pg. Uma compreensão completa da relação entre vias degradativas e sintéticas do metabolismo PG poderia dar origem a alvos antibióticos inexplorados anteriormente.

Embora tenha havido avanços significativos na metodologia para estudar a glicobiologia em eucariotes, a glicobiologia bacteriana e, em particular, o metabolismo PG não avançou a uma taxa semelhante. As abordagens químicas atuais para estudar o metabolismo PG incluem antibióticos fluorescentes^{rotulados 18}, sondas fluorescentes^19,20 e rotulagem metabólica 21,22,23,24. Essas novas abordagens estão fornecendo novas maneiras de interrogar o metabolismo da parede celular bacteriana. Embora algumas dessas estratégias sejam capazes de rotular PG in vivo, elas podem ser específicas de espécies¹⁹, ou apenas trabalhar em cepas sem uma autolysina^{particular 25}. Muitas estratégias de rotulagem PG destinam-se ao uso com paredes celulares isoladas²⁶ ou com vias de biossíntese PG in vitro reconstituídas 20,27,28. Atualmente, o uso de antibióticos fluorescentes é limitado a etapas biossintéticas e transpeptidação¹⁸.

O conhecimento atual das autolysinas bacterianas e seu papel no metabolismo da parede celular vem da análise bioquímica genética e in vitro 11,29,30,31,32. Embora essas abordagens tenham fornecido uma riqueza de informações sobre esta importante classe de enzimas, decifrar seu papel biológico pode ser desafiador. Por exemplo, devido à redundância funcional³³, a exclusão de uma autolise na maioria dos casos não resulta em interrupção do crescimento bacteriano. Isso apesar de seu papel implícito no crescimento celular e na divisão ^7,12. Outra complicação é que a exclusão genética de autolysinas bacterianas pode dar origem a meta-fenótipos³⁴. Os meta-fenótipos surgem da complexa interação entre a via afetada pela exclusão genética e outras vias interconectadas. Por exemplo, um meta-fenótipo pode surgir através de um efeito direto, como a falta de uma enzima, ou um efeito indireto, como uma interrupção dos reguladores.

Atualmente, existem apenas alguns inibidores de glicosidase autolysinas como N-acetylglucosaminidases (GlcNAcase) e N-acetylmuramidases, que podem ser usados como sondas químicas para estudar a degradação de PG. Para lidar com isso, a diamide masarimicina (anteriormente denominada fgkc) foi identificada e caracterizada³⁵ como um inibidor bacteriostático do crescimento de subtilis bacilo que tem como alvo o GlcNAcase LytG³² (Figura 1). LytG é um exo-ator glcNAcase³⁶, um membro do cluster 2 dentro da família de hidrolase glicosyl 73 (GH73). É o maior GlcNAcase ativo durante o crescimento vegetativo³². Pelo que sabemos, a masarimicina é o primeiro inibidor de um GLCNAcase de ação pg que inibe o crescimento celular. Estudos adicionais de masarimicina com Streptococcus pneumoniae descobriram que a masarimicina provavelmente inibe o metabolismo da parede celular neste organismo³⁷. Aqui, a preparação da masarimicina é relatada para uso como uma sonda de biologia química para estudar fisiologia nos organismos Gram-positivos B. subtilis, e S. pneumoniae. Exemplos de análise morfológica do tratamento de concentração inibitória submínica com masarimicina, bem como um ensaio de sinergia/antagonismo são apresentados. Ensaios de sinergia e antagonismo usando antibióticos com modos de ação bem definidos podem ser uma maneira útil de explorar conexões entre processos celulares 38,39,40.