グラム陽性細菌増殖の小分子阻害剤であるマサリマイシンの合成
概要
細胞壁分解を標的とすることによって枯草菌および肺炎球菌の増殖を阻害する小分子プローブである静菌ジアミドマサリマイシンを調製するための詳細なプロトコールが提示される。化学プローブとしてのその応用は、枯草菌および肺炎菌との相乗効果/拮抗アッセイおよび形態学的研究において実証されている。
Abstract
細菌の細胞壁にあるペプチドグリカン(PG)は、形状、および周囲の環境からの保護を付与するユニークな高分子構造である。細胞の成長と分裂を理解する上で中心的なのは、PG分解が生合成と細胞壁アセンブリにどのように影響するかについての知識です。近年、修飾糖やアミノ酸の導入によるPGの代謝標識が報告されている。小分子阻害剤による生合成ステップの化学的尋問は可能であるが、オートライシンによるPG分解を研究するためのケミカルバイオロジーツールは未開発である。細菌性オートライシンは、PGの緊密に協調した分解に関与する幅広いクラスの酵素である。ここでは、枯 草菌 におけるN-アセチルグルコサミニダーゼLytGの阻害剤である小分子プローブ、マサリマイシン、および 肺炎球菌における細胞壁代謝を調製するための詳細なプロトコールが提示される。マイクロ波支援および古典的有機合成 を介 した阻害剤の調製が提供される。生物学的アッセイにおけるグラム陽性生理学を研究するためのツールとしてのその適用性が提示される。
Introduction
ペプチドグリカン(PG)は、グラム陽性およびグラム陰性細菌1,2の両方における細胞の形状および構造を描写する網目状のポリマーである。このヘテロポリマーは、β-(1,4)結合した交互のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基とN-アセチルムラミン酸(MurNAc)残基からなる骨格を有する短いペプチド3,4,5,6によって架橋されたアミノ糖のマトリックスである(図1)1。MurNAcのC-3ラクチル部分に結合しているのはステムペプチドである。PGの代謝は、細胞壁7、8に新しい物質を組み込むために、生合成および分解酵素の緊密に調整されたシステムを含む。PGの分解は、オートライシン9と総称する酵素によって行われ、さらに切断された結合の特異性に基づいて分類される。オートライシンは、細胞増殖、細胞分裂、運動性、PG成熟、走化性、タンパク質分泌、遺伝的能力、分化、および病原性を含む多くの細胞プロセスに関与する10,11。個々のオートライシンの特定の生物学的機能を解明することは、部分的には機能的な冗長性のために、困難な場合があります。しかし、最近の生物物理学的研究8,12,13および計算研究12は、PG代謝におけるそれらの役割についての新しい洞察を提供している。加えて、最近の報告は、PG代謝における合成14および膜媒介性15、16、17ステップについてのさらなる洞察を提供している。PG代謝の分解経路と合成経路の関係を徹底的に理解することは、これまで未開発の抗生物質標的を生じさせる可能性がある。
真核生物の糖生物学を研究するための方法論には著しい進歩があったが、細菌の糖生物学、特にPG代謝は同様の速度で進歩していない。PG代謝を研究するための現在の化学的アプローチには、蛍光標識抗生物質18、蛍光プローブ19、20、および代謝標識21、22、23、24が含まれる。これらの新しいアプローチは、細菌の細胞壁代謝を調査する新しい方法を提供している。これらの戦略のいくつかはインビボでPGを標識することができるが、それらは種特異的であり得る19、または特定のオートライシン25を欠く株においてのみ働く。多くのPG標識戦略は、単離された細胞壁26またはインビトロで再構成されたPG生合成経路20、27、28と共に使用するためのものである。蛍光標識された抗生物質の使用は、現在、生合成ステップおよびトランスペプテーション18に限定されている。
細菌のオートライシンと細胞壁代謝におけるそれらの役割に関する現在の知識は、遺伝的およびインビトロ生化学的分析11、29、30、31、32から来ている。これらのアプローチは、この重要なクラスの酵素に関する豊富な情報を提供してきましたが、それらの生物学的役割を解読することは困難な場合があります。例えば、機能的冗長性33のために、ほとんどの場合、オートライシンの欠失は細菌増殖の停止をもたらさない。これは、細胞増殖および分裂におけるそれらの暗黙の役割にもかかわらず、7,12である。もう一つの合併症は、細菌性自己分解体の遺伝的欠失がメタ表現型を生じさせる可能性があることである34。メタ表現型は、遺伝的欠失の影響を受ける経路と他の相互接続された経路との間の複雑な相互作用から生じる。例えば、メタ表現型は、酵素の欠如などの直接的な効果、または調節因子の破壊などの間接的な効果を介して生じ得る。
現在、PGの分解を研究するための化学プローブとして使用できるN-アセチルグルコサミニダーゼ(GlcNAcase)およびN-アセチルムラミダーゼなどのグリコシダーゼ自己分解の阻害剤はごくわずかである。これに対処するために、ジアミドマサリマイシン(以前はfgkcと呼ばれていた)が同定され、GlcNAcase LytG32を標的とする枯草菌増殖の静菌阻害剤として35を特徴付けた(図1)。LytGは、外効性GlcNAcase36であり、グリコシル加水分解酵素ファミリー73(GH73)内のクラスター2のメンバーである。これは、栄養成長中の主要な活性GlcNAcaseである32。我々の知る限り、マサリマイシンは、細胞増殖を阻害するPG作用型GlcNAcaseの最初の阻害剤である。肺炎連鎖球菌を用いたマサリマイシンのさらなる研究は、マサリマイシンがこの生物における細胞壁代謝を阻害する可能性が高いことを見出した37。ここで、マサリマイシンの調製は、グラム陽性生物B.枯草菌、および肺炎菌における生理学を研究するためのケミカルバイオロジープローブとしての使用について報告されている。マサリマイシンによる最小阻害濃度以下の処理の形態学的解析、ならびに相乗効果/拮抗作用アッセイの例を提示する。明確に定義された作用機序を有する抗生物質を用いた相乗効果および拮抗作用アッセイは、細胞プロセス間の関連を探求する有用な方法であり得る38、39、40。
Protocol
1. 一般的な方法 注:すべての化合物は標準的な供給業者から購入され、それ以上の精製なしで使用されました。 シリカゲルXG F254でプレコートしたアルミニウム板上で薄層クロマトグラフィー(TLC)を行う。UVランプの下、 p-アニスアルデヒド染色剤に浸漬するか、I2 蒸気にさらすことによってスポットを検出します。 すべての核磁…
Representative Results
マサリマイシンは、枯草菌および肺炎菌の小分子静菌阻害剤であり、枯草菌35、37における外効性GlcNAcase LytGを阻害し、肺炎菌37における細胞壁を標的とすることが示されている。マサリマイシンは、55%〜70%の範囲の収率を有する古典的またはマイクロ波支援有機合成のいずれかによって効率的に調製する…
Discussion
マサリマイシンは、枯草菌35および肺炎菌37増殖の単一微小モル静菌阻害剤である。枯草菌では、マサリマイシンがGlcNAcase LytG35を阻害することが示されているが、肺炎菌の細胞壁における正確な分子標的は同定されていない37。古典的な有機合成またはマイクロ波手順のいずれかを用いたマサリマイシ…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、助成金番号2009522の下で国立科学財団によって支援されました。マサリマイシンのNMR分析は、米国国立科学財団の助成金番号1919644の下で主要な研究機器プログラム賞によって支援されました。この資料で表明された意見、所見、結論、または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映するものではありません。
Materials
| 2-Iodobenzoic acid | SIGMA-ALDRICH | I7675-25G | corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder |
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 109827-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Acetonitrile | SIGMA-ALDRICH | 34851-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| Aluminum backed silica plates | Sorbtech | 4434126 | silica gel XG F254 on aluminum backed plates |
| chloroform-d | SIGMA-ALDRICH | 151823-50G | solvent for NMR |
| Compact Mass Spectrometer | Advion-Interchim | Advion CMS | compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe |
| Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile | fisher chemical | 07-200-90 | for synergy/antagonism assays |
| cover slips | fisher chemical | 12-547 | for microscopy |
| Cyclohexanecarboxaldehyde | CHEM-IMPEX INT'L INC. | 24451 | flammable, irritant, colorless to pink liquid |
| Cyclohexyl isocyanide | SIGMA-ALDRICH | 133302-5G | irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor |
| Cyclohexylamine | SIGMA-ALDRICH | 240648-100ML | corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated |
| Ethyl acetate | SIGMA-ALDRICH | 537446-4L | flammable, irritant, colorless liquid |
| flash silica cartridge (12g) | Advion-Interchim | PF-50SIHP-F0012 | pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin |
| formaldehyde | SIGMA-ALDRICH | F8775-25ML | fixing agent for microscopy |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H8651-25G | buffer for microscopy fixing solution |
| Hexane, mixture of isomers | SIGMA-ALDRICH | 178918-4L | environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid |
| High performance compact mass spectrometer | Advion | expression | Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution |
| High Vac | eppendorf | Vacufuge plus | vacuum aided by centrifugal force and temperature |
| Hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 258148-2.5L | corrosive, irritant, colorless liquid |
| hydrochloric acid | SIGMA-ALDRICH | 320331-2.5L | strong acid |
| immersion oil | fisher chemical | 12-365-19 | for microscopy |
| Iodine, resublimed crystals | Alfa Aesar | 41955 | environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals |
| Mestre Mnova | MestreLab Research | software for processing NMR spectra | |
| Methanol | SIGMA-ALDRICH | 439193-4L | flammable, toxic, health hazard, colorless liquid |
| methylene blue | SIGMA-ALDRICH | M9140-25G | microscopy stain for staining cell walls |
| meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood | fisher chemical | B21176X | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| meuller-hinton broth | fisher chemical | DF0757-17-6 | growth media for Streptococcus pneumoniae |
| microscope slides | fisher chemical | 22-310397 | for microscopy |
| Microwave Synthesis Labstation | MILESTONE | START SYNTH | device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel |
| NMR tubes | SIGMA-ALDRICH | Z562769-5EA | 5mm NMR tubes 600 MHz |
| Nuclear Magnetic Resonance (NMR) | Bruker | Ascend 400 | large superconducting magnet (400MHz) |
| optochin | fisher chemical | AAB21627MC | ethylhydrocupreine hydrochloride |
| petrie plates | Celltreat | 229695 | for preparing agar plates for bacterial growth |
| Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera | Zeiss | for morphology studies | |
| puriFlash | interchim | XS520plus | flash chromatography purification system |
| resazurin | SIGMA-ALDRICH | R7017-1G | for synergy/antagonism assays |
| Rotary Evaporator | Heidolph | Hei-VAP Value "The Collegiate" | solvent evaporator |
| Sodium bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | S6014-500G | irritant, white powder |
| Sodium chloride | fisher chemical | S271-1 | crystalline, colorless |
| Sodium chloride | SIGMA-ALDRICH | S5886-500G | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Sodium sulfate | SIGMA-ALDRICH | 7985592-500G | anhydrous, granular, white |
| tryptone | fisher chemical | BP1421-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Whitney DG250 Workstation | Microbiology International | DG250 | anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen |
| yeast extract | fisher chemical | BP1422-500 | for growth of B.subtilis and preparation of LB media |
| Zen Lite (blue) software | Zeiss | for acquiring micrographs |
参考文献
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