Sintesi di Masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica Gram-positiva

Il peptidoglicano (PG) è un polimero a maglie che delinea la forma e la struttura cellulare nei batteri Gram-positivi e Gram-negativi ^1,2. Questo eteropolimero è una matrice di amminozuccheri reticolati da peptidi corti ^3,4,5,6 con una spina dorsale composta da residui alternati di N-acetilglucosamina (GlcNAc) e acido N-acetilmuramico (MurNAc) legati a β-(1,4) (Figura 1)1. Attaccato alla porzione di lattilo C-3 di MurNAc è il peptide dello stelo. Il metabolismo della PG coinvolge un sistema strettamente coordinato di enzimi biosintetici e degradativi per incorporare nuovo materiale nella parete cellulare ^7,8. La degradazione del PG viene effettuata da enzimi collettivamente denominati autolisine⁹ e ulteriormente classificati in base alla specificità del legame scisso. Le autolisine partecipano a molti processi cellulari tra cui la crescita cellulare, la divisione cellulare, la motilità, la maturazione PG, la chemiotassi, la secrezione proteica, la competenza genetica, la differenziazione e la patogenicità^10,11. Svelare le funzioni biologiche specifiche delle singole autolisine può essere scoraggiante, in parte a causa della ridondanza funzionale. Tuttavia, recenti studi biofisici 8,12,13 e computazionali¹² hanno fornito nuove informazioni sui loro ruoli nel metabolismo pg. Inoltre, recenti rapporti hanno fornito ulteriori informazioni sulla sintesi¹⁴ e sui ^15,16,17 passaggi mediati dalla membrana nel metabolismo pg. Una conoscenza approfondita della relazione tra vie degradative e sintetiche del metabolismo pg potrebbe dare origine a bersagli antibiotici precedentemente non sfruttati.

Mentre ci sono stati progressi significativi nella metodologia per studiare la glicobiologia negli eucarioti, la glicobiologia batterica e, in particolare, il metabolismo PG non è avanzato a un ritmo simile. Gli attuali approcci chimici per studiare il metabolismo pg includono antibiotici marcati fluorescentemente¹⁸, sonde fluorescenti ^19,20 e etichettatura metabolica 21,22,23,24. Questi nuovi approcci stanno fornendo nuovi modi per interrogare il metabolismo della parete cellulare batterica. Mentre alcune di queste strategie sono in grado di etichettare PG in vivo, possono essere specie-specifiche¹⁹, o funzionare solo in ceppi privi di una particolare autolisina²⁵. Molte strategie di marcatura PG sono destinate all’uso con pareti cellulari isolate²⁶ o con vie di biosintesi PG ricostituite in vitro 20,27,28. L’uso di antibiotici marcati con fluorescenza è attualmente limitato alle fasi biosintetiche e alla transpeptidazione¹⁸.

Le attuali conoscenze sulle autolisine batteriche e sul loro ruolo nel metabolismo della parete cellulare provengono da analisi genetiche e biochimiche in vitro 11,29,30,31,32. Mentre questi approcci hanno fornito una ricchezza di informazioni su questa importante classe di enzimi, decifrare il loro ruolo biologico può essere difficile. Ad esempio, a causa della ridondanza funzionale³³, la cancellazione di un’autolisina nella maggior parte dei casi non comporta l’arresto della crescita batterica. Questo nonostante il loro ruolo implicito nella crescita e divisione cellulare ^7,12. Un’altra complicazione è che la delezione genetica delle autolisine batteriche può dare origine a meta-fenotipi³⁴. I metafenotipi derivano dalla complessa interazione tra la via interessata dalla delezione genetica e altre vie interconnesse. Ad esempio, un meta-fenotipo può insorgere attraverso un effetto diretto come la mancanza di un enzima o un effetto indiretto come un’interruzione dei regolatori.

Attualmente, ci sono solo pochi inibitori delle autolisine della glicosidasi come N-acetilglucosaminidasi (GlcNAcase) e N-acetilmuramidasi, che possono essere utilizzati come sonde chimiche per studiare la degradazione del PG. Per risolvere questo problema, la diamide masarimicina (precedentemente definita come fgkc) è stata identificata e caratterizzata^{con 35} come inibitore batteriostatico della crescita del Bacillus subtilis che prende di mira il GlcNAcase LytG³² (Figura 1). LytG è un GlcNAcase³⁶ eso-agente, membro del cluster 2 all’interno della famiglia 73 della glicosil idrolasi (GH73). È il principale GlcNAcase attivo durante la crescita vegetativa³². Per quanto ne sappiamo, la masarimicina è il primo inibitore di un GlcNAcase ad azione PG che inibisce la crescita cellulare. Ulteriori studi sulla masarimicina con Streptococcus pneumoniae hanno scoperto che la masarimicina probabilmente inibisce il metabolismo della parete cellulare in questo organismo³⁷. Qui, la preparazione di masarimicina è segnalata per l’uso come sonda di biologia chimica per studiare la fisiologia negli organismi Gram-positivi B. subtilis e S. pneumoniae. Vengono presentati esempi di analisi morfologica del trattamento con concentrazione inibitoria sub-minima con masarimicina, nonché un test di sinergia/antagonismo. I saggi di sinergia e antagonismo con antibiotici con modalità d’azione ben definite possono essere un modo utile per esplorare le connessioni tra i processi cellulari 38,39,40.