כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב ניתוח ספקטרומטריה המונית של מטבוליטים פנוליים בפלזמה של קשישים
概要
מטרת פרוטוקול זה היא לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה באמצעות שיטת ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה ממוקדת למחצה.
Abstract
קבוצה של 23 קשישים קיבלה ארוחות פונקציונליות (משקה ומאפין) שפותחו במיוחד למניעת סרקופניה (אובדן מסת שריר הקשורה לגיל). דגימות פלזמה נלקחו בתחילת ההתערבות ולאחר 30 ימים של צריכת הארוחות הפונקציונליות. כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב עם ניתוח מסה דו-מושבית (UPLC-MS/MS) בוצעה כדי לזהות תרכובות פנוליות והמטבוליטים שלהן. חלבוני פלזמה היו מזורזים עם אתנול והדגימות היו מרוכזות ו resuspended בשלב הנייד (1:1 acetonitrile: מים) לפני הזרקה למכשיר UPLC-MS / MS. ההפרדה בוצעה עם עמודת שלב הפוך C18 , ותרכובות זוהו באמצעות המסה הניסיונית שלהם, הפצה איזוטופית, ודפוס שבר. תרכובות עניין הושוו לאלה של מאגרי נתונים וספרייה ממוקדת למחצה פנימית. תוצאות ראשוניות הראו כי המטבוליטים העיקריים שזוהו לאחר ההתערבות היו חומצה פנילצטית, גליציטין, 3-הידרוקסיפנילוולרית, וגומיסין M2.
Introduction
סרקופיניה היא הפרעת שלד מתקדמת הקשורה לאובדן מואץ של שרירים באוכלוסייה המבוגרת. מצב זה מגביר את הסיכון לנפילות ומוביל לפעילות מוגבלת של חיי היומיום. סרקופיניה קיימת בכ-5%-10% מהאנשים מעל גיל 65 וכ-50% מבני 80 ומעלה1. לא אושרו תרופות ספציפיות לטיפול בסרקופיניה, ולכן מניעה עם פעילות גופנית ותזונה מאוזנת היטב חשובה 1,2. התערבויות תזונתיות עם מזונות שפותחו במיוחד מועשרים בחלבון חלב וחומצות אמינו חיוניות הראו תוצאות חיוביות במניעת סרקופניה2. במחקרים אחרים, המחברים כללו ויטמינים ונוגדי חמצון, כמו ויטמין E ואיזופלבונים, בתזונה, הגדלת היתרונות לרווח שרירים על המותניים והירכיים3.
ברוסימום עליקסטרום סובה (בספרדית: Brosimum alicastrum Sw. ) הוא עץ הגדל באזורים הטרופיים של מקסיקו. זה כבר נצרך על ידי תרבויות המאיה בשל הערך התזונתי הגבוה שלה4. זהו מקור טוב של חלבון, סיבים, מינרלים, ונוגדי חמצון פנוליים, כגון חומצה כלורוגנית5. מאז זה יכול להיות טחון לאבקה ומשמש במוצרי אפייה או נצרך משקאות, מחקרים אחרונים העריכו את השילוב של קמח זרעי רמון (RSF) לתוך מזונות שונים כדי לשפר את הערך התזונתי שלהם. משקה בטעם קפוצ’ינו בתוספת RSF פותח, שהיה עשיר בסיבים תזונתיים והיה בו יותר מ-6 גרם חלבון למנה, והיה מקובל מאוד על הצרכנים; לכן, זה נחשב חלופה פוטנציאלית לעמידה בדרישות תזונתיות מיוחדות6. במחקר מעקב, RSF שימש גם כדי לנסח מאפין ומשקה חדש עשיר בחלבון, סיבים תזונתיים, micronutrients, ונוגדי חמצון פנוליים. המאפין והמשקה שימשו בהתערבות תזונתית לקשישים, שצרכו את שני המוצרים פעמיים ביום במשך 30 יום. לאחר תקופה זו, המצב התזונתי והסרקופי של המשתתפים השתפר, ואת התוכן הפנולי הכולל של פלזמה גדל7. עם זאת, הקביעה של סך התרכובות פנוליות בפלזמה בוצעה על ידי שיטה ספקטרופוטומטרית, ולכן זיהוי של תרכובות פנוליות בפועל שנקלטו לא היה אפשרי; יתר על כן, שיטה זו אינה ספציפית לחלוטין עבור תרכובות פנוליות, ולכן כמה הערכת יתר עלולה להתרחש8.
זיהוי וכימות של תרכובות פנוליות הנספגות לאחר צריכת מזונות עשירים בנוגדי חמצון אלה היא משימה קשה אך יש צורך להדגים את הפעילות הביולוגית של פיטוכימיקלים אלה. הזמינות הביולוגית של רוב התרכובות הפנוליות נמוכה; פחות מ -5% מהם ניתן למצוא ללא שינוי מבני בפלזמה. תרכובות פנוליות עוברות מספר ביוטרנספורמציות, כגון מתילציה, סולפונציה או גלוקורונידציה, המתבצעות על ידי enterocytes ו hepatocytes9. תרכובות פנוליות הן גם biotransformed על ידי המיקרוביוטה לתוך קטבוליטים חיידקיים שעשויים להפעיל את ההשפעות המועילות שלהם בגוף לאחר נספג לתוך פלזמה10. לדוגמה, חומצה פנילאצטית היא תוצר של טרנספורמציה חיידקית של פלבנואידים ופרואנתוציאנידינים אוליגומריים, אשר יכול לעכב עד 40% של חיידקים (Escherichia coli) הידבקות בדרכי השתן לאחר צריכת חמוציות11.
המגוון המבני של תרכובות פנוליות טבעיות, הוסיף למגוון של המטבוליטים שלהם ואת הזמינות הביולוגית הנמוכה שלהם, עושה את הזיהוי שלהם בפלזמה אפילו יותר מאתגר. פרופיל מטבולומי, באמצעות פלטפורמות ניתוח ספקטרוסקופיות כמו תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרוסקופיית מסה טנדם (MS/ MS), היא כנראה הגישה הטובה ביותר להשגת מטרה זו; למרבה הצער, הציוד אינו נגיש בקלות, ופיתוח פרוטוקולי ניתוח עדיין מוגבל12. מספר מחקרים דיווחו על טרשת נפוצה /טרשת נפוצה בשילוב עם מערכת הפרדה (כגון כרומטוגרפיה נוזלית) כאסטרטגיה להפחתת המורכבות של ספקטרום המסה במחקרים מטבולומיים. ההקדמה האחרונה של שיטות הפרדה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC) צמצמה את זמן הניתוח והגדילה את הרזולוציה והרגישות בהשוואה לפרוטוקולים נוזליים קונבנציונליים בעלי ביצועים גבוהים, כך שמערכות UPLC-MS/MS התקבלו במהירות באופן נרחב על ידי קהילת חילוף החומרים האנליטית13. בדרך זו, כמה מחקרים חקרו מטבוליטים פנוליים וזיהו נגזרות glucuronidated מחומצה caffeic, קוורצטין, וחומצה פרולית, כמו גם נגזרות sulfonated מחומצה סירינגית וניל בפלזמה של אנשים לאחר צריכת חמוציות14. פרוטוקולים קודמים התכוונו למצוא תרכובות פנוליות ומטבוליטים פנוליים ביופלואידים כגון פלזמה. פרוטוקולים אלה התבססו על זיהוי וכימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) יחד עם גלאי UV-vis15. עם זאת, פרוטוקולים כאלה דורשים שימוש בסטנדרטים אותנטיים כדי להעריך זיהוי מוחלט וכימות מדויק. מגוון רחב של מחקרים זיהו את המטבוליטים הנפוצים ביותר ביופלוידים (צורות זועפות, glucuronidated ומתילציה) על ידי UPLC-MS ו UPLC-MS / MS; עם זאת, חלק גדול של מטבוליטים חיידקיים לא דווח בשל היעדר מסדי נתונים המכילים את המידע המלא שלהם16. זיהוי מטבוליט מסובך על ידי העלות והזמינות המסחרית של תקני מטבוליט. לכן, האסטרטגיה הטובה ביותר עשויה להיות לא ממוקדת או חצי ממוקדת ניתוח מטבוליטים MS / MS, אשר מסתמך על השימוש במידע תכונה מולקולרית (m / z, מסה מדויקת מונואיסטופית, הפצה איזוטופית, ודפוס פיצול) כדי לקבוע את הזהות הכימית ומשווה אותו עם מסדי נתונים מקוונים זמינים באופן חופשי המכילים מטבוליטים פוליפנול מזוהים ביופלוידים לאחר צריכת פוליפוליפנול-richts12 . מסדי הנתונים החשובים ביותר המשמשים במחקרי UPLC-MS/MS לזיהוי תרכובות פנוליות והמטבוליטים שלהם הם מסד הנתונים של מטבולום אנושי (HMDB), ספריית ליפידבלסט, ספריית METLIN, ומאגרי מידע משלימים אחרים, כגון PubChem, ChemSpider, ו- Phenol Explorer17.
במחקר הנוכחי פותחה שיטת UPLC-MS/MS ממוקדת למחצה לניתוח דגימות הפלזמה של קבוצת הקשישים המעורבים במחקר צריכת המאפינס והמשקאות המכיל RSF7. נתונים ממאגרי מידע מקוונים שונים בחינם של מטבוליטים פלזמה נאספו ושולבו במסד נתונים מיוחד. מסד נתונים זה ניתן לגשת באופן אוטומטי על ידי תוכנת הציוד כדי לזהות את המטבוליטים פוליפנולי בחמש דגימות פלזמה לפני ואחרי ההתערבות התזונתית 30 יום. זה נעשה כדי לזהות את התרכובות הפנוליות העיקריות, או המטבוליטים שלהם, כי הם נספגים מן מזונות פונקציונליים מנוסחים במיוחד שנועדו למניעת סרקופיניה.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי וכימות של פיטוכימיקלים ביואקטיביים הנספגים לאחר צריכת תוסף מזון או מזון חיוניים להדגמה והבנה של היתרונות הבריאותיים של תרכובות אלה ואת המזונות המכילים אותם. בעבודה הנוכחית פותחה שיטת UPLC-MS/MS, שמטרתה רק זיהוי של התרכובות הפנוליות העיקריות והמטבוליטים שלהן שהגדילו את הריכוז בפלזמה ל?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה על התמיכה הכספית של CONACYT, מקסיקו (CB- 2016-01-286449), ו- UACJ-PIVA (פרויקטים 313-17-16 ו 335-18-13). OAMB רוצה להודות CONACYT למלגת הדוקטורט שלו. תמיכה טכנית ממשרד ייצור המולטימדיה של UACJ מוכרת בהכרת תודה.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
参考文献
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi, ., Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
