T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비
概要
여기에서 우리는 비드 지원 지질 Bilayers를 사용하여 합성 항원 제시 세포의 단계별 재구성을 위한 프로토콜을 제시하고 활성화된 T 세포에서 시냅스 출력을 심문하는 그들의 사용.
Abstract
항원 제시 세포(APC)는 물리적 접촉에 종사하는 T 세포에 3개의 활성화 신호를 제시한다: 1) 항원, 2) 비용 절임/코어프레스, 및 3) 수용성 사이토카인. T 세포는 활성화에 응하여 이펙터 입자의 2종류를 방출합니다: 세포간 메신저와 중화 세포 독성을 각각 전송하는 트랜스 시냅스 소포(tSV) 및 수근 분자 공격 입자. 이러한 엔터티는 T 셀과의 물리적 접촉에 종사하는 APC에 의해 빠르게 내면화되어 특성화가 어려워집니다. 이 논문은 비드 지원 지질 양층(BSLBs)을 항원 제시 세포(APC) 모방으로 제조하고 사용하여 이러한 시냅스 입자를 포착하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 또한 세포 표면에 단백질 밀도의 절대 측정을 위한 프로토콜, 그러한 생리적 수준으로 BSLB의 재구성, T 세포에 의한 시냅스 입자 방출을 추적하기 위한 유동 세포측정 절차 등이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 개별 단백질, 복잡한 리간드 혼합물, 병원균 결정제 및 약물의 효과를 조력자 T 세포, 세포 독성 T 림프구, 규제 T 세포 및 키메라 항원 수용체 발현 T 세포(CART)를 포함한 T 세포의 이펙터 출력에 대한 효과를 연구하도록 조정할 수 있다.
Introduction
면역학적 시냅스(IS)는 병트라크 정보의 조절된 교환을 용이하게 하는 물리적 접촉에 종사하는 세포의 인터페이스에서 형성된 중추적인 분자 구조이다. 다른 IS는 문헌에 기술되었습니다, 증거의 성장 몸은 이 분자 허브가 세포 네트워크의 보존 된 기능임을 시사한다. B 세포, 자연 킬러 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 T 세포를 포함한 다양한 면역 세포는 단명 한 접촉1의 조립을 통해 정보를 교환합니다. 다세포 연구는 병원성 세포 네트워크를 운전하고 알 수없는 기능을 가진 표면 단백질을 표현하는 백혈구와 기질 세포의 새로운 하위 집합에 대한 이해를 발전시키고 있습니다. 합성 APC로서, BSLB는 신호, 즉 항원 및 비용 절전/코어 프레스의 통합에서 개별 단백질의 기능적 역할에 대한 직접적인 조사를 허용하고, T 세포및 신호 4라고 하는 이펙터 입자의 결과 방출을 허용한다.
이 문서에서는 BSLB를 사용하여 모델 APC의 표면 구성을 모방하는 동안 고려해야 할 프로토콜 및 중요한 기술 포인트를 설명합니다. APC에 면역 수용체 및 기타 표면 단백질의 정량적 측정을 위한 프로토콜은 이러한 측정된 양을 포함하는 합성 APC의 재구성을 위한 프로토콜과 함께 제시된다. 이어서, T 세포와 BSLB를 응모하는 데 필요한 단계는 유동 세포측정법을 사용하여 트랜스 시냅스 입자 전달의 정량적 측정을 위한 프로토콜과 함께 제시된다. 가장 놀랍게도, BSLBs는 시냅스 ectosomes (SEs)라고 불리는 tSV의 플라즈마 막 유래 인구를 연구하는 것을 용이하게합니다. T 세포 항원 수용체 농축(TCR+) SEs는 TCR 트리거ing2에 반응하여 창고되고 BSLBs3에 의해 효율적으로 포획되며, 이는 항원 및 모델링된 멤브레인 조성물의 작용특성을 평가하기 위한 우수한 판독을 나타낸다. CD63+ 엑소좀 및 수퍼분자 공격 입자(SMAP)는 또한 자극된 T 세포에 의해 방출되고 BSLBs에 의해 포획된다. 그(것)들은 T 세포에 의하여 활성화 및 결과 엑소세포 및 lytic 과립 분비의 추가 판독으로 이용될 수 있습니다. T 세포의 상호작용극에 외세포 소포의 동원은 또한 활성화에 대한 응답으로 IL-2, IFN-γ 및 IL-10과 같은 사이토카인의 방향 방출을 용이하게 한다4,5,6,7,8. T 세포 방출 된 사이토카인은 또한 BSLBs에서 검출될 수 있더라도, 면역학적 시냅스에서 사이토카인 방출의 정량적 분석을 검증하기 위하여 더 헌신적인 연구 결과는 현재 개발되고 있습니다.
특정 멤브레인 조성이 T 세포의 시냅스 출력에 미치는 영향을 심문하려면 표적 멤브레인 성분의 생리적 밀도를 정의해야 합니다. 세포 표면 단백질의 유동 세포측정 기반 정량화는 이 프로토콜에서 필수적인 단계이며, 항체당 불소크롬의 알려진 수(F/P) 및 2) 벤치마크 비드의 사용은 측정된 평균 형광 성소 인텐션(MFIs)에서 형광 분자를 보간하는 표준 기준을 제공한다.
이러한 벤치마크 표준은 5개의 구슬 모집단으로 구성되며, 각각 임의형 광채 검출의 동적 범위에 걸쳐 있는 동등한 용해성 형광(MESFs)의 수가 증가하고 있습니다. 이러한 표준 인구는 간단한 선형 회귀에 의해 임의형형 단위를 MESF로 변환하는 것을 용이하게 하는 이산 형광 피크를 산출합니다. 결과 MESFs는 그 때 세포 당 결합된 분자의 평균 수를 계산하기 위하여 항체 F/P 값과 함께 이용됩니다 (또는 나중에 단계에서 BSLB). 검출된 분자의 평균 수에 추정된 세포 표면 영역의 응용은 분자/μm2로 생리적 밀도의 계산을 가능하게 합니다. 이러한 정량화 프로토콜은 또한 T 세포에 대한 단백질 밀도 의 측정및 동종성 T 세포 시냅스의 형성을 중재하는 막 조성물의 생화학적 재구성(즉, T-T 시냅스9)에 적응될 수 있다. 필요한 경우, 항체 결합의 valency는 분자 당 불소크롬의 알려진 숫자로 표지된 재조합 표적을 사용하여 더 추정될 수 있습니다. 이어서, 항체 결합 발렛은 결합형 형광 단백질및 정량화 항체의 수를 동시에 비교하여 동일한 BSLB 집단에 대해 계산될 수 있다(2개의 상이한 정량화 형광 및 MESF 표준을 사용).
APC 멤브레인의 재구성은 실리카 구슬1에 지원되는 지질 양층(SLBs)의 조립이 필요합니다. 상이한 인지질종을 함유하는 리포솜 스톡은 다재다능한 지질 이중층 매트릭스를 형성하기 위해 활용될 수 있으며, 상이한 결합 화학을 이용한 재조합 단백질의 고정을 가능하게 한다(리포솜의 제조는 10에서 상세하다). 관련 리간드의 생리밀도(또는 밀도)가 정의되면, 동일한 유동 세포측정 프로토콜은 표적 생리밀도로 BSLB를 코팅하는 데 필요한 재조합 단백질의 농도를 추정하도록 조정된다. 두 개의 서로 다른 앵커링 시스템을 조합하거나 별도로 사용할 수 있습니다.
첫째, Ni2+함유 인지질의 최종 12.5 mol%를 함유하는 SLB는 평방 마이크로란10 당 약 10,000개의 그의 태그 결합 부위를 제공하기에 충분하며, 생리학적 밀도가 최대 적재 용량을 초과하지 않는 대부분의 상업적으로 이용 가능한 단백질로 BSLB를 장식하는 데 효과적입니다. 두 번째 로딩 시스템은 스테렙타비딘 다리를 통해 바이오티닝 방지 CD3e Fab(또는 HLA/MHC 모노머)을 적재하기 위해 비오틴 함유 인지질(mol%)을 이용합니다. 이러한 두 가지 BSLB 장식 방법의 조합은 합성 APC로 BSLBs의 유연한 테일러링을 가능하게합니다. 매우 복잡한 APC 표면 조성물의 경우, 인지질및 단백질의 몰%는 당면한 질문만큼 많은 단백질을 적재하도록 증가시킬 수 있다. 단백질의 작동 농도와 바이오타이니지의 몰%가 정의되면, BSLB는 다중 파라메트릭 유동 세포측정을 사용하여 T 세포의 시냅스 출력을 심문하기 위해 조립될 수 있다.
Protocol
1. 정량적 유동 세포측정을 사용하여 세포 표면 단백질 밀도 측정 EDTA(최종 2mM 농도)와 인간 AB 혈청(최종 10%)을 첨가하여 0.22 μm 필터링된 인간 유동 세포측정 버퍼(hFCB)를 멸균 인산완충식염수(PBS), pH 7.4( 표 1 참조)를 준비한다. 0.22 μm 모공 필터 유닛을 사용하여 용액을 필터링하여 혈청 불순물을 제거하고 4°C에 보관합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 300 × g</e…
Representative Results
세포 표면에 절대 단백질 정량화를 위한 FCM리간드의 생리밀도를 제시하는 BSLBs의 재구성은 모델링된 세포 하위 집합에 대한 총 단백질 밀도의 추정을 요구한다. BSLB를 재구성하기 위해, ICAM-1 및 비용 류 분자와 같은 BSLB 와 세포 사이의 접착 및 기능적 상호 작용을 지원하는 단백질과 함께 관심의 신호 축에서 역할을 할 것으로 예상되는 관련 리간드(CD80 및 CD86)를 포함한다. 추가 단?…
Discussion
BSLB는 모델 APC 멤브레인으로 자극된 T 세포의 미립자 출력을 연구하기 위한 다목적 도구입니다. 이 방법의 유연성은 복잡하고 환량주의 막 조성물의 재구성을 통해 리간드의 효과와 그 신호가 tSV 및 수분자 공격 입자 및 그 구성요소의 분비에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다. 우리는 사전 활성화 TH, CTL, Tregs 및 CART15를 포함하여 다양한 T 세포에 이 기술을 시험했습니다. 이 ?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 건설적인 과학적 토론, 특히 우리의 흐름 세포측정 시설 매니저 조나단 웨버에 대한 우리의 실험실 구성원과 류머티즘 지역 사회의 케네디 연구소에 감사드립니다. 이 작품은 웰컴 트러스트 수석 연구 펠로우십 100262Z/12/Z, ERC 고급 보조금(SYNECT AdG 670930), 유금학 연구를 위한 케네디 트러스트(KTRR) (3대 MLD)에 의해 지원되었습니다. PFCD는 EMBO 장기 펠로우십(ALTF 1420-2015)이 유럽위원회(LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) 및 마리 스클로도우스카-퀴리 액션과 옥스포드 브리스톨 마이어스 스퀴브 펠로우십과 함께 지원되었다.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform |
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL |
Gilson | FA10011 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform |
| 200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon® | 352052 | |
| 5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories Inc. | SS05003 | |
| 96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3799 | For FCM staining and co-culture of BSLB and cells. |
| 96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3894 | For FCM staining of cells or beads in suspension. |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A37573 and A20006 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | For normal in tube staining of biological samples for FCM | |
| Aluminum Foil | Any brand | For protecting cells and BSLBs from light | |
| anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 | BioLegend | 310815 and 310818 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD2, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD2, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugate | |
| anti-human CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E. |
| anti-human CD38, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD39, clone A1 | BioLegend | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD4, clone A161A1 | BioLegend | 357414 and 357421 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD4, clone OKT4 | BioLegend | 317414 and 317422 | PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD40, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD40, clone G28.5 | BioLegend | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 and 368516 | Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates |
| anti-human CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 and 353015 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD73, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD80, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD81, clone 5A6 | BioLegend | 349512 and 349502 | PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively. |
| anti-human CD82, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD86, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 and 311402 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 and 307622 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Armenian Hamster IgG |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produced in house | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 and 329902 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human TCRab, clone IP26 | BioLegend | 306712 and 306714 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
| antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson & Company (BD) | 641319 | Performance track of instruments before quantitative FCM |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson & Company (BD) | 23-14523-00 | Acquisition software |
| Bovine Seum Albumin | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
| CaCl2, Calcium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% |
| Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
| DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12321D | For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL |
| DynaMag™-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12301D | For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL |
| Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | For the exclusion of dead cells during analyses |
| FlowJo | Becton Dickinson & Company (BD) | Version 10.7.1 | Analysis software |
| Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation) |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
| HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture |
| HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 51026282 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Hula Mixer® Sample Mixer | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings. |
| Human Serum Albumin, 30% aqueous solution | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
| Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples |
| Innovatis CASY cell counter and analyzer TT | Biovendis Products GmbH | For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current. | |
| KCl, Potassium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
| MgCl2, Magessium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture |
| Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
| Mini Incubator | Labnet International | I5110A-230V | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2 |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
| Mouse IgG polyclonal antibody control | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively. |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 and 400355 | Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively |
| Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma | Falcon | 353046 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Na2HPO4, Disodium Phosphate | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl, Sodium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% |
| NiSO4, Nickel(II) sulfate | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | For saturating NTA sites; added during the blocking process |
| Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | No Ca2+ or Mg2+ added |
| Polyethersulfone (PES) Filter unit | Thermo Scientific Nalgene | UY-06730-43 | Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content |
| PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC. |
| Purified Streptavidin | BioLegend | 280302 | |
| Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
| RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
| Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations |
| Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15022C.1 | |
| Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS. |
| Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15063 | |
| RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements. |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
| Sprout mini centrifuge | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes. |
| Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
| Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | 89882 |
参考文献
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