T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

免疫学的シナプス(IS)は、物理的接触に従事する細胞の界面に形成される極めて重要な分子構造であり、ジュクストラクリン情報の調節された交換を促進する。さまざまなISが文献に記載されており、これらの分子ハブが細胞ネットワークの保存された特徴であることを示唆する証拠が増えています。B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、T細胞などのさまざまな免疫細胞は、短命の接点¹の集合を介して情報を交換します。マルチオーミック研究は、病原性細胞ネットワークを駆動し、未知の機能を有する表面タンパク質を発現する白血球および間質細胞の新規サブセットの理解を進めている。合成APCとして、BSLBは、T細胞による活性化シグナル、すなわち抗原および共刺激/コアプレッションの統合における個々のタンパク質の機能的役割の直接的な調査を可能にし、その結果、シグナル4と呼ばれるエフェクター粒子の放出を可能にする。

このホワイトペーパーでは、BSLBを使用してモデルAPCの表面組成を模倣する際に考慮すべきプロトコルと重要な技術的ポイントについて説明します。APC上の免疫受容体および他の表面タンパク質の定量的測定のためのプロトコルは、これらの測定された量を含む合成APCの再構成のためのプロトコルと共に提示される。次に、T細胞とBSLBの共培養に必要なステップを、フローサイトメトリーを用いたシナプス間貫通粒子移動の定量的測定のためのプロトコールとともに提示する。最も驚くべきことに、BSLBは、シナプスエクトソーム(SE)と呼ばれるtSVの原形質膜由来集団の研究を容易にする。T細胞抗原受容体富化(TCR⁺)SEは、TCR^{トリガー2}に応答して放出され、BSLBs3によって効率的に捕捉され、抗原およびモデル化された膜組成のアゴニスト特性を評価するための優れた読み出しを表す。CD63⁺エキソソームおよび超分子攻撃粒子(SMAP)も、刺激されたT細胞によって放出され、BSLBによって捕捉される。それらは、T細胞による活性化および結果として生じる外分泌性および溶解性顆粒分泌の追加の読み出しとして使用することができる。T細胞の相互作用極への外来小胞の動員はまた、活性化に応答してIL−2、IFN−γ、およびIL−10などのサイトカインの指向性放出を促進する^4、5、^6、7、8。T細胞放出サイトカインはBSLBでも検出できるが、免疫学的シナプスにおけるサイトカイン放出の定量的解析を検証するためのより献身的な研究が現在開発中である。

特定の膜組成がT細胞のシナプス出力にどのように影響するかを調べるには、標的膜成分の生理学的密度を定義する必要があります。細胞表面タンパク質のフローサイトメトリーベースの定量は、このプロトコルの重要なステップであり、1)抗体あたりの蛍光色素数(F/P)が既知である抗体の使用、および2)測定された平均蛍光強度(MFI)から蛍光色素分子を補間するための標準的な基準を提供するベンチマークビーズが必要です。

これらのベンチマーク標準は、5つのビーズ集団で構成され、それぞれが任意の蛍光検出のダイナミックレンジにまたがる同等の可溶性蛍光色素(MESF)の数を増やしています。これらの標準集団は離散的な蛍光ピークを生成し、単純な線形回帰によって任意の蛍光単位のMESFへの変換を容易にする。得られたMESFは、抗体F/P値とともに使用され、細胞当たりの結合分子の平均数(または後のステップではBSLB)を計算する。推定された細胞表面積を平均検出分子数に適用することで、生理学的密度を分子/^μm2として計算することができます。この定量化プロトコルはまた、T細胞上のタンパク質密度の測定およびホモタイプT細胞シナプス(すなわち、T−Tシナプス⁹)の形成を媒介する膜組成物の生化学的再構成にも適合させることができる。必要に応じて、抗体結合の価数は、1分子当たり既知の数の蛍光色素で標識された組換え標的を使用することによってさらに推定することができる。次いで、結合蛍光タンパク質の数と定量抗体とを同時に比較することによって(2つの異なる定量蛍光色素およびMESF標準を使用)、同じBSLB集団に対する抗体結合価数を計算することができる。

APC膜の再構成には、シリカビーズ上に支持された脂質二重層(SLB)を組み立てる必要があります¹。異なるリン脂質種を含むリポソームストックを利用して、汎用性の高い脂質二重層マトリックスを形成することができ、異なる結合化学を有する組換えタンパク質のアンカーリングを可能にする(リポソームの調製は ¹⁰に詳述されている)。「細胞上」の関連するリガンドの生理学的密度(または密度)が定義されると、同じフローサイトメトリープロトコルが、BSLBsを標的生理学的密度で被覆するのに必要な組換えタンパク質の濃度を推定するように適合される。2つの異なるアンカーシステムは、組み合わせて使用することも、別々に使用することもできます。

第1に、最終的な12.5モル%の^Ni2+含有リン脂質を含有するSLBは、1平方ミクロンあたり約10,000個のHisタグ結合部位を提供するのに十分であり¹⁰ 、生理学的密度がこの最大負荷容量を超えないほとんどの市販タンパク質でBSLBを装飾するのによく機能する。第2のローディングシステムは、ビオチン含有リン脂質(モル%)を利用して、ストレプトアビジン架橋を介してビオチン化抗CD3e Fab(またはHLA/MHCモノマー)をロードする。これら2つのBSLB装飾方法を組み合わせることで、BSLBを合成APCとして柔軟に調整できます。非常に複雑なAPC表面組成の場合、リン脂質およびタンパク質のmol%を増加させて、手元の質問が必要とするだけ多くのタンパク質を負荷することができる。タンパク質の作用濃度とビオチン化リン脂質のmol%が定義されると、BSLBを組み立てて、マルチパラメトリックフローサイトメトリーでT細胞のシナプス出力を調べることができます。