Préparation de bicouches lipidiques soutenues par des perles pour étudier la production de particules des synapses immunitaires des lymphocytes T

La synapse immunologique (IS) est une structure moléculaire pivot formée à l’interface des cellules engagées dans un contact physique qui facilite l’échange régulé d’informations sur la juxtracrine. Différents SYSTÈMES ont été décrits dans la littérature, et un nombre croissant de preuves suggère que ces centres moléculaires sont une caractéristique conservée des réseaux cellulaires. Diverses cellules immunitaires, y compris les cellules B, les cellules tueuses naturelles, les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules T, échangent des informations via l’assemblage de contacts de courte ^durée1. Les études multiomiques font progresser la compréhension de nouveaux sous-ensembles de leucocytes et de cellules stromales conduisant des réseaux cellulaires pathogènes et exprimant des protéines de surface aux fonctions inconnues. En tant qu’APC synthétiques, les BSLEB permettent l’étude directe du rôle fonctionnel des protéines individuelles dans l’intégration des signaux activateurs, à savoir les antigènes et la costimulation/corépression, par les lymphocytes T et la libération résultante de particules effectrices appelées signal quatre.

Cet article décrit les protocoles et les points techniques critiques à prendre en compte lors de l’utilisation de BSLB pour imiter la composition de surface des APC modèles. Les protocoles pour la mesure quantitative des récepteurs immunitaires et d’autres protéines de surface sur les APC sont présentés avec le protocole pour la reconstitution des APC synthétiques contenant ces quantités mesurées. Ensuite, les étapes nécessaires à la coculture des lymphocytes T et du BSLB sont présentées avec le protocole de mesure quantitative du transfert transsynaptique de particules à l’aide de la cytométrie en flux. Plus remarquable encore, les BSLB facilitent l’étude d’une population dérivée de la membrane plasmique de tSV appelées ectosomes synaptiques (SE). Les SE enrichis en récepteurs d’antigènes des lymphocytes T (TCR⁺) sont éliminés en réponse au déclenchement du ^TCR2 et capturés efficacement par les BSLB3, ce qui représente une excellente lecture pour évaluer les propriétés agonistes des antigènes et la composition membranaire modélisée. Les exosomes CD63⁺ et les particules d’attaque supramoléculaire (SAP) sont également libérés par les lymphocytes T stimulés et capturés par les BSLB. Ils peuvent être utilisés comme lectures supplémentaires de l’activation et de la sécrétion de granules exocytaires et lytiques qui en résultent par les lymphocytes T. La mobilisation des vésicules exocytaires vers le pôle en interaction de la cellule T facilite également la libération directionnelle de cytokines, telles que l’IL-2, l’IFN-γ et l’IL-10 en réponse à l’activation4,5,6,7,8. Bien que les cytokines libérées par les lymphocytes T puissent également être détectées sur les BSLEB, une étude plus dédiée est actuellement en cours de développement pour valider l’analyse quantitative de la libération de cytokines au niveau de la synapse immunologique.

Pour interroger comment des compositions membranaires spécifiques influencent le rendement synaptique des lymphocytes T, il faut définir la densité physiologique du composant membranaire cible. Les quantifications basées sur la cytométrie en flux des protéines de surface cellulaire sont une étape essentielle de ce protocole et nécessitent : 1) l’utilisation d’anticorps avec un nombre connu de fluorochromes par anticorps (F/P), et 2) des billes de référence fournissant une référence standard pour l’interpolation des molécules de fluorochrome à partir des intensités moyennes de fluorescence (IMF) mesurées.

Ces étalons de référence se composent de cinq populations de billes, chacune contenant un nombre croissant de fluorochromes solubles équivalents (MESF), qui couvrent la plage dynamique de la détection arbitraire par fluorescence. Ces populations standard produisent des pics de fluorescence discrets, facilitant la conversion d’unités de fluorescence arbitraires en MESF par simple régression linéaire. Les MESF résultants sont ensuite utilisés avec les valeurs f/P des anticorps pour calculer le nombre moyen de molécules liées par cellule (ou BSLB dans les étapes ultérieures). L’application de surfaces cellulaires estimées au nombre moyen de molécules détectées permet alors le calcul de densités physiologiques sous forme de molécules/^μm2. Ce protocole de quantification peut également être adapté à la mesure des densités protéiques sur les lymphocytes T et à la reconstitution biochimique des compositions membranaires médiant la formation de synapses homotypiques des lymphocytes T (c.-à-d. synapses T-T9). Si nécessaire, la valence de la liaison aux anticorps peut être davantage estimée en utilisant des cibles recombinantes marquées avec un nombre connu de fluorochromes par molécule. Ensuite, la valence de liaison aux anticorps peut être calculée pour la même population BSLB en comparant simultanément le nombre de protéines fluorescentes liées et d’anticorps de quantification (en utilisant deux fluorochromes de quantification différents et des normes MESF).

La reconstitution des membranes APC nécessite l’assemblage de bicouches lipidiques supportées (SLB) sur des billes de ^silice1. Les stocks de liposomes contenant différentes espèces de phospholipides peuvent être exploités pour former une matrice lipido-bicouche polyvalente, permettant l’ancrage de protéines recombinantes avec une chimie de liaison différente (la préparation des liposomes est détaillée en ¹⁰). Une fois que la densité physiologique (ou les densités) du ligand pertinent « sur les cellules » est définie, le même protocole de cytométrie en flux est adapté pour estimer la concentration de protéine recombinante nécessaire pour recouvrir les BSLB de la densité physiologique cible. Deux systèmes d’ancrage différents peuvent être utilisés en combinaison ou séparément.

Tout d’abord, le SLB contenant un dernier 12,5 mol% de phospholipides contenant du ^Ni2+ est suffisant pour fournir environ 10 000 sites de liaison His-tag par micron ^carré10 et fonctionne bien pour décorer les BSLB avec la plupart des protéines disponibles dans le commerce dont les densités physiologiques ne dépassent pas cette capacité de charge maximale. Le deuxième système de chargement exploite les phospholipides contenant de la biotine (en mol%) pour charger des anti-CD3e Fab biotinylés (ou monomères HLA/MHC) via des ponts streptavidines. La combinaison de ces deux méthodes de décoration BSLB permet ensuite la personnalisation flexible des BSLB en tant qu’APC synthétiques. Pour les compositions de surface APC très complexes, le mol% de phospholipides et de protéines peut être augmenté pour charger autant de protéines que la question en question l’exige. Une fois que les concentrations de travail des protéines et mol% des phospholipides biotinylés sont définies, les BSLB peuvent être assemblés pour interroger la sortie synaptique des lymphocytes T avec cytométrie en flux multiparamétrique.