制备珠状支持脂质双分子层研究T细胞免疫突触的颗粒输出

免疫突触（IS）是在从事物理接触的细胞界面处形成的关键分子结构，其促进并列素信息的调节交换。文献中已经描述了不同的智能体，越来越多的证据表明这些分子集线器是蜂窝网络的保守特征。各种免疫细胞，包括B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，通过短寿命接触的组装来交换信息¹。多组学研究正在推进对驱动致病性细胞网络并表达具有未知功能的表面蛋白的白细胞和基质细胞的新亚群的理解。作为合成的APC，BSLB允许直接研究单个蛋白质在T细胞整合激活信号（即抗原和共刺激/共压）中的功能作用，以及由此产生的效应颗粒的释放，称为信号四。

本文描述了在使用BSLB模拟模型APC的表面组成时要考虑的协议和关键技术要点。提出了用于定量测量APC上免疫受体和其他表面蛋白的方案以及用于重建含有这些测量量的合成APC的方案。然后，提出共培养T细胞和BSLB所需的步骤以及使用流式细胞术定量测量跨突触颗粒转移的方案。最值得注意的是，BSLB有助于研究称为突触外接体（SEs）的质膜衍生的tSV群体。T细胞抗原受体富集（TCR ⁺）SEs响应于TCR触发²而脱落，并被BSLBs3有效捕获，代表了评估抗原和模拟膜组成的激动特性的出色读数。CD63 ⁺外泌体和超分子攻击颗粒（SMAP）也被刺激的T细胞释放并被BSLBs捕获。它们可以用作激活的额外读数以及T细胞分泌的外细胞和裂解颗粒。外细胞囊泡向T细胞相互作用极的动员也有助于细胞因子的定向释放，例如IL-2，IFN-γ和IL-10响应于激活^{4，5，6，7，8}。虽然T细胞释放的细胞因子也可以在BSLBs上检测到，但目前正在开发一项更专门的研究，以验证免疫突触中细胞因子释放的定量分析。

为了询问特定的膜组成如何影响T细胞的突触输出，需要定义靶膜组分的生理密度。基于流式细胞术的细胞表面蛋白定量是该方案中必不可少的步骤，需要：1）使用每个抗体具有已知荧光染料数（F / P）的抗体，以及2）基准微球，为从测量的平均荧光强度（MFI）插值荧光染料分子提供标准参考。

这些基准标准品由五个微球群体组成，每个微球群体包含越来越多的等效可溶性荧光染料（MESF），这些荧光素跨越任意荧光检测的动态范围。这些标准群体产生离散的荧光峰，有助于通过简单的线性回归将任意荧光单元转换为MESF。然后将得到的MESF与抗体F / P值一起使用，以计算每个细胞（或后续步骤中的BSLB）结合分子的平均数量。将估计的细胞表面积应用于检测到的分子的平均数量，然后能够将生理密度计算为分子/ ^μm2。该定量方案还可以适用于测量T细胞上的蛋白质密度和介导同型T细胞突触（即T-T突触⁹）形成的膜组合物的生化重建。如果需要，可以通过使用标记每个分子已知数量的荧光色素的重组靶标来进一步估计抗体结合的效价。然后，通过同时比较结合的荧光蛋白和定量抗体的数量（使用两种不同的定量荧光染料和MESF标准品），可以计算同一BSLB群体的抗体结合价。

APC膜的重构需要在硅微珠上组装支撑的脂质双分子层（SLB）¹。可以利用含有不同磷脂物种的脂质体储液形成多功能脂质 – 双层基质，从而能够锚定具有不同结合化学性质的重组蛋白（脂质体的制备详见 ¹⁰）。一旦定义了”细胞上”相关配体的生理密度（或密度），就可以使用相同的流式细胞术方案来估计涂覆具有目标生理密度的BSLBs所需的重组蛋白的浓度。两种不同的锚固系统可以组合使用，也可以单独使用。

首先，含有最终12.5摩尔%的含^{Ni2 +}磷脂的SLB足以提供每平方微米约10，000个His标签结合位点¹⁰ ，并且能够很好地用大多数市售蛋白质装饰BSLB，其生理密度不超过此最大负载能力。第二种负载系统利用含生物素的磷脂（以摩尔为单位）通过链霉亲和素桥加载生物素化的抗CD3e Fab（或HLA / MHC单体）。这两种BSLB装饰方法的结合使得BSLB能够灵活地定制为合成APC。对于高度复杂的APC表面组合物，磷脂和蛋白质的摩尔%可以增加，以加载手头问题所需的尽可能多的蛋白质。一旦定义了蛋白质的工作浓度和生物素化磷脂的摩尔%，就可以组装BSLB以使用多参数流式细胞术询问T细胞的突触输出。