牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

1. メタクリレートされたカバーリップの調製 注:ガラスカバーリップはPAヒドロゲルを共有結合するためにメタクリレートされ、細胞とのインキュベーション中に剥離を防ぎます。顕微鏡のガラスカバーリップは、高い画質を達成するために使用されます。 300 mL溶液を調製するには、清潔な400 mLガラスビーカーを取り、ヒュームフードの内側に置きます。 ビーカーに10mLの二重蒸留水(ddH2O)を加えます。18.75 mLの酢酸(≥99.8%プロ分析、p.a.)、18.75 mLの3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート、252.5 mLのエタノール(≥99.8%p.a.)を血清学的ピペットを使用して追加します。結晶化皿に溶液を注ぎます。 精密なワイプと24のmmの丸いガラスカバーリップをきれいにしなさい。カバーリップをカスタムメイドのポリテトラフルエチレンラックに入れます。 ラックを溶液に浸し、室温(RT)で15分間インキュベートします。 ラックを取り、エタノール(99.8%p.a.)ですべてのカバースリップをすすいでください。気流の下でカバースリップを乾かします。注意:メタクリレートカバーリップは、RTで最大1ヶ月間保存することができます。 ガラスカバーリップ上の細胞外マトリックスタンパク質のマイクロパターン化 注:ガラスカバーリップは、タンパク質と細胞忌避剤で構成される分子の層でコーティングされています。この層は、次いで、光パターン化技術を用いて除去され、その後の微小パターン化領域における細胞外マトリックスタンパク質の沈着を可能にする。 15mmの丸いガラスのカバースリップを取り、ペトリ皿の上に置きます。カバースリップの上面にダイヤモンドペンを使用します。その後、0.4mbarで酸素プラズマ処理を 行い 、2分間200Wで洗浄を進めます。 ピペット100 μLの0.01%ポリL-リジン溶液を各カバースリップの表面に取り付けます。RTで30分間インキュベート 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)pH 8.5でカバースリップを洗浄します。余分な液体を取り除くが、表面を濡らしたままにする。 ピペット100 μL 50 mg/mLポリ(エチレングリコール)メチルエーテルコハニミジルバレリック酸(mPEG-SVA)を10 mM HEPES pH 8.5の各カバースリップの表面に。RTで1時間インキュベート、10 mM HEPES pH 8.5でカバーリップをリンスし、空気流下で乾燥させます。 2 μL の UV 感度光化用光化(例えば、PLPP-ゲル)を加え、その後に 40 μL のエタノール (≥99.8p.a.) を表面に加えます。表面にゲルとエタノールの均質な分布を得るために、ペトリ皿を前後に静かに傾けます。溶液が重合するまで5分待ちます。 35 mm のペトリ皿の中にカバースリップを 1 つ入れ、底に 20 mm の穴を開けます。これにより、下から来るレーザー光がガラス表面に直接到達することができます。 顕微鏡と光のパターニングモジュールをオンにします(この装置の操作は、レーザー安全担当者からの安全導入後にのみ許可されます)。20x空気の目的でUV-Aレーザーを較正します。フォトイチエータを使ってサンプルをステージに上ろします。ガラスの表面に焦点を合わせ、フォーカスコントロールをオンにします。描画済みパターンをロードしてロックします。 Inkscape のようなグラフィックソフトウェアを使用してパターンを準備します。パターンファイルがDMD寸法(20 xレンズ(0.28 μm/px)の552 x 325 μmに相当する1824 x 1140 px)を超えないようにしてください。注: パターンファイルサイズとして DMD サイズ(1824 x 1140 ピクセル)を使用することをお勧めします。たとえば、1830 x 1130 ピクセルのサイズのパターン ファイルは生成しないでください。 ポリアクリルアミドへのパターン転送を目的として、ガラスの中心から端まで半径の60%~70%のパターン化を行ってください。 単一のセルのパターン化には、パターン間の距離が100 μm、直径が150~300 μmの直径50~100μmのセルグループを使用します。適切なパターンサイズは、典型的な細胞サイズに大きく依存し、細胞が付着できるように十分に大きくする必要があります。 30 mJ/mm2のUV線量によるパターニングを開始します。パターン作成の期間は、パターンの数によって異なります。1 つのパターンを作成するには、約 1 s かかります。 パターニングステップを完了した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で表面を3回リンスします。1x PBSに溶解した25 μg/mLフィブロネクチンの100 μLと、25 μg/mL フィブリノーゲンAlexa488コンジュゲートをPBSで1時間RTでインキュベートします。他のECMタンパク質の場合、パターン化された領域を完全に覆う最適濃度を見つけてください。 1x PBSで表面を3回リンスします。パターン化されたガラスが直ちにガラスPAの転写に使用されることを確認します。ヒドロゲル調製中にパターン化ガラスをRTでPBSに保管します。 3. パターン化ポリアクリルアミドヒドロゲルの製造 注:ポリアクリルアミドヒドロゲルは、酸化N-ヒドロキセチルアクリルアミド(HEA)を含む、表面上のマトリックスタンパク質の共有結合のための反応性アルデヒド基を提示するために調製される。さらに、ハイドロゲルの最上層にのみ蛍光ビーズを埋め込む二層アプローチは、牽引力顕微鏡実験中のビーズ変位の記録を改善するために使用される。 メタクリレートされたガラスのカバーリップをペトリ皿に入れます。 新鮮な酸化HEA溶液を調製するには、15 mL遠心分離管に9.55mLの二重蒸留水を加えます。その後、0.5 mLのHEAを加え、42mgのナトリウム(メタ)を加え、10mLの溶液を得る。溶液を暗闇の中で4時間連続にかき混ぜる。 表1に記載のアクリルアミド、ビスアクリルアミド、及び二重蒸留水を混合して、10mLのストック溶液ヒドロゲルを得る(フームフードの下で行う、モノマーは神経毒性である)。ドガと気密シールに蓋を閉じます。注:ストックソリューションは、4°Cで最大1年間アリコートに保管することができます。 使用前に常にヒドロゲルのヤング率を特徴付ける。 二重層PAヒドロゲルを準備します(ヒュームフードの下でそれを行う、モノマーは神経毒性です)。 1.5 mLチューブに99.3 μLのストック液、1%の過硫酸アンモニウム(APS)の0.5 μL、テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)0.2 μL を軽く混合して下層から始めます。溶液から10μLを取り、メタクリレートカバースリップの中央に滴下します。 15mmの丸いカバースリップを液滴に慎重に置き、重合のために45分待ちます。上部カバースリップをメスでそっと取り外します。 最上層では、93.3 μLofストック溶液を1μLの新鮮な酸化HEA溶液、5 μLの蛍光ビーズ(200 nmサイズのビーズの場合は1平方マイクロンあたり3個)、1%APSの0.5 μL、TEMEDの0.2 μLを1.5mLチューブにそっと混合します。溶液から5μLを取り、ピペットは既に重合された底層の中心に滴下します。 マイクロパターンのカバースリップを液滴の上にそっと置きます。液滴が重合するまでRTで45分待ちます。パターン化された側面が液滴に触れられるようにします。カバースリップをメスでそっと取り外します。 24 mm のカバーリップを、2 成分のシリコーン接着剤を使用して、カスタムドリル 6 ウェル プレートの底に接着します。5分後、井戸にPBSを加えます。 原子間力顕微鏡(AFM)によるポリアクリルアミドヒドロゲルサンプルのヤング率を特徴付ける。 AFMホルダーに球状の先端の片持ち面を取り付けます。 硬質基板(例えば、ガラスやマイカ)上の力距離曲線(3-4 Vセットポイント)を取得して各片持ちレバーを校正し、カンチレバー感度を推定し、表面から引き込み、熱的なチューンを行ってばねを一定にします。 調整されたカンチレバーをヒドロゲルサンプルの上に置き、次のパラメータを使用して、PBSバッファーに力曲線を取得します:20-30 nN力セットポイント、5または10 μm/sアプローチと引き込み速度、5 μmランプサイズ。注:逆向きの光学顕微鏡は、空気40x目的と緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルタを装備し、PAヒドロゲルサンプル内のECMマイクロパターン化された領域を視覚化し、標的化するために使用されました。 AFM 解析ソフトウェアを使用して、取得した力と距離曲線をプロットします。 接触点を見つけ、力対距離曲線を力とインデント曲線に変換します。 0.2 と 0.5 のポアソン比を使用して、Hertz モデル(または先端ジオメトリの機能で適切な力学モデル)でカーブのインデント部分をフィットさせます。 4. UV-Aレーザー照明による細胞牽引力の局所放出(LUVI-TFM) 注:UV-Aレーザーは、ヒドロゲルの定義された領域に局在する細胞の牽引力を放出するために適用されます。UV-Aレーザー(すなわち、λ=375 nmの固体レーザー、<15 mW)はクラス3Bレーザーである。シールドされていないレーザービームは、目には危険であり、しばしば皮膚にとって危険です。反射光と散乱光と放射線は危険な場合があります。また、紫外線は皮膚癌を引き起こす可能性があります。デバイスの操作は、レーザー安全担当者からの安全導入後にのみ許可されます。 井戸からPBSを吸引します。 シード 3 x 106 細胞 6 ウェルプレートあたりの成長培地.線維芽細胞の場合は、L-グルタミンを含む高グルコースダルベックコの改変イーグル培地(DMEM)を使用し、10%胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加します。細胞を一晩37°C/5%CO2でインキュベートする。サンプルを洗浄して、顕微鏡を開始する前に浮遊細胞を除去します。 顕微鏡のインキュベーションチャンバーとガス供給をオンにして、37°Cと5%のCO2 雰囲気の温度を得ます。 顕微鏡とレーザーパターニングモジュールをオンにします。必要に応じて、レオナルドソフトウェアを使用して20x空気目標にUV-Aレーザーを再較正します。カスタムメイドの6ウェルプレートをサンプルと一緒にステージに置きます。PA の表面に焦点を合わせます。 イルミネーション パターンを設定し、対象のセルにマークを付けます。ヒドロゲルの表面に再び焦点を合わせます。明視野チャネルのセルの画像を取得します。Cy5チャネル(遠赤色フィルター、650 nm励起、670 nm放射)に切り替え、変形状態のビーズの画像を撮ります。 レーザーチャンネルにシフトします。レーザーを3分間オンにします。私たちの特定のセットアップでは、これは6,000 mJ / mm2の光量に対応しました。 Cy5チャンネルに切り替えて、未変形状態のビーズの画像を取得します。注:マウス胚性線維芽細胞を使用した実験では、15分の露光後に参照/変形していない画像を記録します( 代表結果 セクションを参照)。他の種類のセルでは異なる場合があります。別のセルに対して、手順 4.5 ~ 4.7 を繰り返します。 UV-A照射後の酸化ストレス上昇を測定するために、市販の試薬(CellRox)を用いる。CellRoxは、還元された状態で非蛍光性であり、かつ、活性酸素種によって酸化されると、最大〜665nmの発光を有する蛍光を発する。 提供されたプロトコルに従って、5 μMの試薬を画像化媒体に加え、37°C/5%CO2で30分間インキュベートします。次いで、細胞3xを温かい1x PBSで洗浄し、イメージング媒体を交換する。同様の光露光を用いて、UV-A照明の前後に蛍光イメージングによりCy5信号を記録する。 5. 画像処理、粒子画像の軌跡と牽引力の計算 注: 細胞牽引力は、蛍光ビーズの変位を分析して記録され、粒子画像のvelocimetryに基づく画像解析ツールを使用して計算されます。 開いている蛍光ビーズ画像は、フィジーを使用してレーザー(すなわち、変形)前(すなわち、変形)後に。2 つのイメージを 1 つのスタックとしてマージする (イメージ |スタック |スタックするイメージ)。 StackRegプラグイン(P.テベナズ、スイス連邦工科大学ローザンヌ)を使用して、2つの画像間の横ドリフトを修正します。イメージを 8 ビットに変更する (イメージ |タイプ|8ビット)と1024 x 1024 pixに再スケール(画像|スケール)。参照イメージを使用してイメージ シーケンス (TIFF 形式) として保存します。 OpenPIV プロジェクトで実装されている PIV フィールドから相互相関テクニック 19 を使用して変位ベクトルフィールドを取得します。 リラックスした(変形されていない)画像と変形した画像が、サイズwRとwDの検索ウィンドウでピクセル単位で覆われていることを確認します。各検索ウィンドウに対して、次の式を使用して相互相関関数を定義します。ここで、R(i,j) と D(i,j) は、選択した検索ウィンドウに切り捨てられ、その後にミラーパッドが入った 2 つの画像の強度フィールドを記述します。その平均値を記述します。ウィンドウサイズは wR = 32 と wD = 32 に選択され、隣接する検索ウィンドウ間で 70% のオーバーラップが使用されます。 各検索ウィンドウで、相互相関関数を最適化する変位ベクトル を決定し、検索ウィンドウの中心位置に割り当てます。サブピクセル精度は、20のように最大領域の周囲にガウスフィットを使用して得られます。 あいまいな変位ベクトルを検索して削除します。1.5のしきい値より下の相互相関関数の2つの最も高い局所的な最大値間の比率があいまい 21 と見なされる検索ウィンドウに対応する変位ベクトル。 残存しきい値 1.522 の正規化された中央値検定に失敗した変位ベクトルを破棄します。 (オプション)すべての変位から固定ベクトル を引いて、残りの横ドリフトを補正します。これは、選択した領域の変位がセルから遠く離れているために行われます。 3 次多項式補間を使用して、結果の変位ベクトルフィールドを、入力画像の間隔 4 ピクセルの通常のグリッドに補間します。欠落しているデータポイントは、滑らかな二変量スプラインの外挿を使用して塗りつぶされます。ディスプレイスメントベクトル(ピクセル単位)は、画像のピクセル比(20xエアレンズの場合は0.33 μm/px)によって局所的な変形に関連しています。 (オプション)後の解析での呼び出し音のアーティファクトを減らすために、イメージをミラーパッドにします。 変形フィールドに Tukey ウィンドウ関数を掛け合わせると、0.2-0.3 のパラメータを使用して、ドリフト補正によるエッジ効果を排除します。この実験では、FOVの中心にあるマイクロパターン化された領域が注目される。 規則化フーリエ変換トラクションサイトメトリー(FTTC)18を使用してトラクションを再構築します。正規化として、最も簡単な合理的な選択、すなわち、0番目 のオーダーティホノフ(L2)の正規化23、24、25を使用します。最適な正規化パラメータ λは、26 で定義された一般化交差検証(GCV)関数を最小化するために選択されます。ここでτλは、すべてのフーリエサンプリングモードに対するλの与えられた値に対する再構成されたトラクションフィールドのxおよびy成分を含む積層ベクトルであり、GはFTTCに対して定義されているとおり、対応する変位フィールドに対するトラクションフィールドをマッピングする線形演算子である。合計はベクトルコンポーネント上で実行されています。ui は、すべてのフーリエサンプリングモードの変位フィールドの x および y 成分です。GCVは、不適切な逆問題の分野で広く使用されており、TFMでよく使用されるL曲線基準に代わる良い代替手段です。ランツコスフィルタは、周波数空間が限られており、ディスプレイスメントフィールドアップサンプリングが原因で発生するアーティファクトを削減するために使用されます。トラクション計算は、ヤングのPAの係数(例えば、11.3 kPa)とポアソンの比率(例えば、架橋濃度に応じて0.2と0.5の範囲のPA)に依存する。