עמודי כרומטוגרפיה של זיקה לממברנת התא לזיהוי מטבוליטים מיוחדים של צמחים המקיימים אינטראקציה עם קולטן Tropomyosin Kinase משותק B

תערובות בוטניות עשירות בתרכובות פעילות פרמקולוגית¹, משמשות כמקור טוב לזיהוי להיטים של תרופות חדשות ומובילות 2,3,4,5. הגילוי של תרופות חדשות ממוצרים טבעיים היה גישה פורייה ותרופות רבות שאושרו כיום מקורן בתרכובות שזוהו לראשונה בטבע. המגוון הכימי של תרכובות טבעיות קשה להתאמה על ידי ספריות מעשה ידי אדם של מולקולות מסונתזות כימית. תרכובות טבעיות רבות מתקשרות עם מטרות חלבונים אנושיות ומווסתות אותן, ויכולות להיחשב למולקולות דמויות-תרופה שעברו אופטימיזציה אבולוציונית⁶. תרכובות טבעיות אלה מתאימות במיוחד לזיהוי עופרת סמים לשימוש בהפרעות נוירולוגיות⁶. שתיים מהתרופות המאושרות כיום על ידי ה-FDA לטיפול במחלת אלצהיימר (AD) מופקות מאלקלואידים טבעיים, כלומר: גלנטמין וריבסטיגמין (נגזרת של physostigmine)⁶. L-DOPA, כיום התרופה הנפוצה ביותר למחלת פרקינסון, זוהתה לראשונה מהשעועית הרחבה (Vicia faba L.) ⁷. פרגוליד וליזורייד, אגוניסטים של קולטן דופמינרגי הם הנגזרות של אלקלואידים ארגוט טבעיים מהפטריה הטפילית Claviceps purpurea⁸. רסרפין, אלקלואיד שבודד מנחש הודי (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) היה אחד התרופות האנטי-פסיכוטיות הראשונות⁹. לאחרונה, תגובה חיסונית לא מווסתת ודלקת מערכתית נקשרו להתפתחות של מחלות נוירולוגיות רבות, כגון הפרעת דיכאון מז’ורי או מחלות נוירודגנרטיביות¹⁰. תזונה מבוססת צמחים יחד עם התערבויות אחרות באורח החיים נמצאה כמשפרת את היכולות הקוגניטיביות והתפקודיות בקרב קשישים 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . מולקולות אלקטרופיליות מסוימות השייכות לטריטרפנים ולפוליפנולים נמצאו כמכשירות תגובות דלקתיות הן במודלים של in vitro והן במודלים in vivo ¹². לדוגמה, תרכובות טבעיות המכילות α,β-קרבוניל בלתי רווי (לדוגמה, כורכומין, סינמאלדהיד), או קבוצת איזותיוציאנטים (למשל, סולפוראפן) מפריעות לדמריזציה של קולטן דמוי אגרה-4 (TLR4) המעכבת את הסינתזה במורד הזרם של ציטוקינים פרו-דלקתיים בקו תאי פרו-B תלויי מורין אינטרלוקין-3^{בקו 12,22} . עדויות אפידמיולוגיות מצביעות על כך שפיטוכימיקלים תזונתיים, הנמצאים במטריצות מזון מורכבות, עשויים גם הם להוות מקור בר קיימא של תרופות חדשות המובילות⁶.

אחד המכשולים העיקריים בזיהוי מולקולות פעילות ביולוגית הנמצאות בתמציות צמחים, כולל מזון צמחי, הוא המורכבות של הדגימות הנחקרות. באופן מסורתי, התרכובות הבודדות מבודדות, מטוהרות, ולאחר מכן נבדקות לפעילות ביולוגית. גישה זו מובילה בדרך כלל לזיהוי התרכובות הנפוצות והמאופיינות ביותר. גישות לגילוי תרופות פנוטיפיות ללא מטרה מולקולרית מוגדרת מסתמכות על פיצול מונחה ביולוגית של תערובות מורכבות²³. בגישה זו, תמצית מחולקת לתת-שברים פחות מורכבים שנבדקים לאחר מכן במבחנים פנוטיפיים. הבידוד והטיהור של תרכובות פעילות מונחים על ידי פעילות ביולוגית המאומתת בבדיקה. הידע על זהותה של מטרה תרופתית מוגדרת עשוי להאיץ באופן משמעותי את זיהוי התרכובות הפעילות מבחינה פרמקולוגית הקיימות בתערובות מורכבות. גישות אלה מבוססות בדרך כלל על אימוביליזציה של המטרה המולקולרית, למשל, אנזים, על משטח מוצק, כמו חרוזים מגנטיים²³. המטרות המשותקות משמשות לאחר מכן בניסויי הסינון וכתוצאה מכך בידוד של תרכובות המקיימות אינטראקציה עם המטרה. בעוד שגישה זו שימשה באופן נרחב בזיהוי תרכובות המכוונות לחלבונים ציטוזוליים, היא יושמה פחות נפוץ בזיהוי כימיקלים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני טרנס-ממברנה (TMPs)²³. אתגר נוסף בשתוק של TMPs נובע מהעובדה שפעילות החלבון תלויה באינטראקציה שלו עם פוספוליפידים של קרום התא ומולקולות אחרות בדו-שכבתיות כגון כולסטרול^23,24. חשוב לשמר את האינטראקציות העדינות האלה בין חלבונים לבין הסביבה הדו-שכבתית הפוספוליפידית הטבעית שלהם כאשר הם מנסים לשתק את המטרה הטרנס-ממברנית.

בכרומטוגרפיה של קרום התא (CMAC) שברי קרום התא, ולא חלבונים מטוהרים, משותקים על חלקיקי הפאזה הנייחים של הממברנה המלאכותית (IAM)²³. פאזות נייחות של IAM מוכנות על ידי חיבור קוולנטי של אנלוגים פוספטידילכולין על סיליקה. לאחרונה פותחו מחלקות חדשניות של שלבים נייחים של IAM שבהן קבוצות אמין וסילנול חופשיות מכוסות סופית (IAM). מחשב אישי. חלקיקי DD2). במהלך הכנת עמודי CMAC שברי קרום התא משותקים על פני השטח של חלקיקי IAM באמצעות ספיחה.

עמודי CMAC שימשו עד כה לשתוק סוגים שונים של TMPs, כולל תעלות יונים (למשל, קולטנים ניקוטיניים), GPCRs (למשל, קולטני אופיואידים), מובילי חלבונים (למשל, p-גליקופרוטאין) ^וכו’24. מטרות החלבון המשותקות שימשו באפיון פרמקודינמיקה (למשל, קבוע דיסוציאציה, Kd) או בקביעת קינטיקה קושרת (k_on ו-k_off) של ליגנדות של מולקולות קטנות המקיימות אינטראקציה עם המטרה וכן בתהליך זיהוי של מובילי תרופות חדשות פוטנציאליים הנמצאים במטריצות מורכבות²⁴ . כאן אנו מציגים את ההכנה של עמודות CMAC עם קולטן tropomyosin קינאז משותק B (TrkB), אשר התגלה כמטרה בת קיימא לגילוי תרופות עבור הפרעות רבות במערכת העצבים.

מחקרים קודמים הראו כי הפעלת הגורם הנוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF)/TrkB קשורה לשיפור של מחלות נוירולוגיות מסוימות, כגון AD או הפרעת דיכאון מז’ורי ^25,26,27,28. דווח כי רמות ה-BDNF והביטוי של הקולטן שלו TrkB יורדים באלצהיימר, והפחתות דומות פוגעות בתפקוד ההיפוקמפוס במודלים של בעלי חיים של²⁹ לספירה. ירידה ברמות של BDNF דווחה בסרום ובמוח של חולי אלצהיימר 30,31,32. ביטוי יתר של טאו או היפר-פוספורילציה נמצאו כמפחיתים את ההנמכה של ביטוי ה-BDNF בתאי עצב ראשוניים ובמודלים של חיות AD 33,34,35. בנוסף, דווח כי ל-BDNF יש השפעות מגינות על רעילות עצבית הנגרמת על ידי β-עמילואיד במבחנה וב-in vivo³⁶. הודגם כי מתן BDNF ישיר למוח החולדה מגביר את הלמידה והזיכרון אצל בעלי חיים לקויים קוגניטיבית³⁷. BDNF/TrkB התגלה כיעד תקף להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, כולל^28,38 לספירה. התמקדות במסלול האיתות BDNF/TrkB לפיתוח טיפולים ב-AD עשויה לשפר את הבנתנו את המחלה³⁹. למרבה הצער, BDNF עצמו לא יכול לשמש כטיפול בגלל התכונות הפרמקוקינטיות הגרועות שלו ותופעות לוואי שליליות⁴⁰. מפעילי מולקולות קטנות של מסלולי TrkB/BDNF נחקרו כליגנדות TrkB פוטנציאליות 41,42,43. בקרב אגוניסטים של מולקולות קטנות שנבדקו, הוכח כי 7,8-דיהידרוקסיפלבון (7,8-DHF) מפעיל את מסלול ה-BDNF/TrkB 41,44,45,46. נגזרת של 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diyl bis(methylcarbamate)) נמצאת כעת בבחינה כתרופה אפשרית עבור AD⁴⁷. לאחרונה, הוכח כי מספר תרופות נוגדות דיכאון פועלות באמצעות קשירת קשר ישיר ל- TrkB וקידום איתות BDNF, מה שמדגיש עוד יותר את החשיבות של רדיפה אחר TrkB כמטרה תקפה לטיפול בהפרעות נוירולוגיות שונות⁴⁸.

הפרוטוקול מתאר את התהליך של הרכבת עמודת TrkB פונקציונלית ועמודת בקרה שלילית TrkB-NULL. העמודות מאופיינות באמצעות מוצר טבעי ידוע ליגנד קטן-מולקולרי: 7,8-DHF. בנוסף, אנו מתארים את תהליך סינון המטריצות המורכבות, תוך שימוש בתמצית צמחים כדוגמה, לזיהוי תרכובות המקיימות אינטראקציה עם TrkB.