골격 근육 미토콘드리아의 단백질 수입 능력 측정
概要
미토콘드리아는 골격 근육에서 높은 수준의 페노티픽 가소성을 나타내는 주요 대사 세포기관입니다. 사이토솔에서 단백질의 수입은 세포기관 생물 발생을 위한 중요한 통로입니다, 망상의 확장 및 미토콘드리아 기능의 유지에 필수적입니다. 따라서, 단백질 수입은 세포 건강의 기압계 역할을 한다.
Abstract
미토콘드리아는 에너지 공급뿐만 아니라 세포의 전반적인 건강을 결정하는 주요 대사 및 조절 세포기관입니다. 골격 근육에서 미토콘드리아는 작은 타원형 세포기관에서 부터 광범위하고 망상과 같은 네트워크에 이르기까지 일련의 복잡한 형태에 존재합니다. 미토콘드리아 망상이 에너지 수요의 변경과 같은 다양한 자극에 대응하여 어떻게 확장되고 발전하는지 이해하는 것은 오랫동안 연구의 주제였습니다. 이러한 성장 또는 생물 발생의 주요 측면은 원래 핵 게놈에 의해 인코딩되고, 사이토솔에서 합성되고, 다양한 미토콘드리아 하위 구획으로 전이되는 전구체 단백질의 수입이다. 미토콘드리아는 단백질 수입 기계(PIM)로 알려진 많은 선택적 내측 및 외부 멤브레인 채널을 포함하는 이러한 수입 공정을 위한 정교한 메커니즘을 개발했습니다. 미토콘드리온으로 수입하는 것은 산화 인산화를 통해 세포기관에서 파생된 ATP의 가용성과 실행 가능한 멤브레인 잠재력및 가용성에 달려 있습니다. 따라서 그 측정은 세포구 건강의 척도로 작용할 수 있습니다. PIM은 또한 세포의 에너지 상태에 단단히 결합되는 골격 근육에 적응가성의 높은 수준을 전시한다. 예를 들어, 운동 훈련은 수입 용량을 증가시키는 것으로 나타났으며, 근육 사용은 미토콘드리아 함량의 마커의 변화와 일치하여 이를 감소시킵니다. 단백질 수입은 미토콘드리아의 생물 발생 및 확장에 있는 중요한 단계이지만, 프로세스는 골격 근육에서 널리 공부되지 않습니다. 따라서, 이 논문은 운동, 건강 및 질병에 있는 세포기관 회전율에 대한 통로의 중요성을 더 잘 이해하고 관련시키는 방법을 촉진하기 위하여 단백질 수입 용량을 측정하기 위하여 골격 근육에서 고립되고 완전하게 기능하는 미토콘드리아를 사용하는 방법을 설명합니다.
Introduction
미토콘드리아는 다른 세포 모형에 있는 복잡한 형태학에 존재하는 세포기관이고 세포 건강에 중요한 기능의 증가 배열을 가지고 있는 것을 인식됩니다. 따라서, 그들은 더 이상 단지 에너지 생산 세포기관에 휘청해질 수 없습니다. 미토콘드리아는 주요 신진 대사 조절제, 세포 운명의 결정요인 및 신호 허브이며, 그 기능은 전반적인 세포 건강의 유용한 지표로 작용할 수 있습니다. 골격 근육 세포에서 전자 현미경 연구는 지리적으로 구별되는 subsarcolemmal (SS) 및 intermyofibrillar (IMF) 미토콘드리아의 존재를 밝혀, 이는 연결의 정도를 나타내는 1,2,3,4 이는 지금 매우 역동적이고 변화 골격 근육 활동 수준에 적응할 수 있음을 인식, 뿐만 아니라 나이와 질병. 미토콘드리아 함량과 근육의 기능은 여러 가지 방법으로 평가될 수 있으며, 세포기질의 영향과 구별되는 미토콘드리아의 호흡기 및 효소 용량(Vmax)을 더 잘 이해하기 위해 기존의 세포 간 절연 방법이 적용되었다. 특히, 이러한 전통적인 방법은 서브사콜렘말과 인터미오피릴라 부위로부터 분리된 미토콘드리아 사이의 미묘한 생화학적 구별을 밝혀왔으며, 이러한 세포외 지역에서 대사에 대한 가능한 기능적 의미를 갖는다8,9,10,11.
미토콘드리아의 생물 발생은 핵과 미토콘드리아 DNA 모두에서 유전자 제품의 기여를 요구하는 데 독특합니다. 그러나, 이들 중 대다수는 mtDNA 전사가 13개의 단백질의 합성으로 만 이어지기 때문에 핵으로부터 유래된다. 미토콘드리아는 일반적으로 다양한 대사 경로에 관여하는 >1000단백질을 포함하기 때문에, 세포기관의 생체발생은 시토솔에서 전구체 단백질의 수입 및 조립을 엄격하게 조절하여 적절한 스토이치오메트리및 기능을 유지하기 위해 다양한 미토콘드리아 하위 구획으로 한다. 미토콘드리아로 향하는 핵으로 구분된 단백질은 일반적으로 세포기관을 대상으로 하는 미토콘드리아 표적 시퀀스(MTS)를 운반하고 하위 구획 국소화를 용이하게 합니다. 대부분의 매트릭스 결합 단백질은 경화 N 단자 MTS를 포함하고, 그 외또는 내부 미토콘드리아 막을 위해 향하는 사람들은 일반적으로 내부 표적 도메인14가 있는 동안. 수입 프로세스는 organelle13에 진입하기 위한 여러 경로를 제공하는 다양한 채널 집합에 의해 수행됩니다. 외부 멤브레인(TOM)의 연막은 사이토솔에서 막 간 공간으로 전구체를 선구체로 이동하여 내부 멤브레인(TIM) 복합체의 트랜스로케이스에 의해 인식된다. 이 단지는 핵으로 인코딩된 전구체를 매트릭스로 수입하여 N 단말 타겟팅 프리시퀀스를 절단하는 작업을 담당합니다. 외부 막을 향한 단백질은 TOM 복합체를 통해 이 막에 직접 삽입될 수 있으며, 내부 막으로 향하는 단백질은 TIM 단백질, 특히 TIM22에 의해 삽입됩니다. 그들의 수입에 따라, 단백질은 상주 proteases 및 chaperones에 의해 추가 처리되고 수시로 전자 수송 사슬에서 찾아낸 것과 같은 더 큰 복합체를 형성하기 위하여 결합합니다.
미토콘드리아 단백질 수입 자체는 또한 미토콘드리아 건강의 측정 역할을 하며, 이 과정은 ATP15 의 형태로 막 잠재력과 에너지원의 존재에 의존하기 때문이다. 예를 들어, 막 전위가 소멸되면, 단백질 키나아제 PINK1은 세포기관에 의해 채택될 수 없으며, 이는 미토파기16,17이라는 경로를 통해 세포기관의 분해의 개시를 유발하는 인산화 신호로 이어집니다. 유사한 상황에서, 수입이 방해될 때, 단백질 ATF5는 세포기관을 입력할 수 없고, 이어서 UPR 유전자 발현의 업 조절을 위한 전사 인자 역할을 하는 핵으로 전염된다18,19. 따라서, 단백질 수입 효율을 측정하는 것은 세포기관의 건강에 대한 포괄적인 통찰력을 제공할 수 있으며, 유전자 발현 반응은 핵에 대한 역행 신호의 정도를 나타내는 데 사용될 수 있다.
미토콘드리아의 생물 발생과 일반적으로 세포 건강에 대한 명백한 중요성에도 불구하고, 포유류 미토콘드리아의 수입 경로는 현저하게 과소 연구. 본 보고서에서는 전구체 단백질의 수입을 골격 근육 미토콘드리아로 측정하는 데 관련된 구체적인 단계를 설명하고 근육 및 사용의 변화에 대한 수입 시스템의 적응 반응을 설명하기 위한 데이터를 제공하여 골격 근육의 적응가성에 대한 단백질 수입의 기여를 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미토콘드리아는 세포 내의 합성 및 확장을 위해 핵과 미토콘드리아 게놈의 발현과 조정에 유일히 의존한다. 그러나, 핵게놈은 미토콘드리아 프로테아메의 대다수(99%)를 인코딩하고, 이것은 미토콘드리아 생물 발생을 지원하는 단백질 수입 기계류의 중요성을 강조한다. 수입은 또한 수입 실패가 전개된 단백질 반응 및/또는 mitophagy15,16,26의 개시를 촉진할 수 있기 때문에 중요한<s…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 맥길 대학의 박사 G.C 쇼어, 워싱턴 의과 대학의 A. 스트라우스 박사, 그리고 라 트로브 대학의 박사.M.T. 라이언이 이 연구에 사용 된 표현 플라스미드의 원래 기부에 감사드립니다. 이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)에서 D. A. Hood에 대한 자금 지원을 받았습니다. D. A. 후드는 또한 세포 생리학에 있는 캐나다 연구 의자의 홀더입니다.
Materials
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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