Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico

I mitocondri sono organelli che esistono in morfologie complesse in diversi tipi di cellule e sono riconosciuti per possedere una gamma crescente di funzioni che sono fondamentali per la salute cellulare. In quanto tali, non possono più essere ridotti semplicemente agli organelli che producono energia. I mitocondri sono regolatori metabolici chiave, determinanti del destino cellulare e hub di segnalazione, le cui funzioni possono servire come utili indicatori della salute cellulare generale. Nelle cellule muscolari scheletriche, gli studi di microscopia elettronica rivelano la presenza di mitocondri subsarcolemmali (SS) e intermiofibrillari (IMF) geograficamente distinti, che mostrano un grado di ^{connettività1,2,3,4} che è ora riconosciuto come altamente dinamico e adattabile ai cambiamenti nei livelli di attività muscolare scheletrica, nonché con l’età e la malattia. Il contenuto e la funzione mitocondriale nel muscolo possono essere valutati in numerosi ^modi5,6 e sono stati applicati metodi tradizionali di isolamento degli organelli per comprendere meglio le capacità respiratorie ed enzimatiche (Vmax) dei mitocondri distinte dall’influenza dell’ambiente ^cellulare7,8. In particolare, questi metodi tradizionali hanno rivelato sottili distinzioni biochimiche tra mitocondri isolati dalle regioni subsarcolemmali e intermiofibrillari, smentendo possibili implicazioni funzionali per il metabolismo in queste regioni subcellulari8,9,10,11.

La biogenesi dei mitocondri è unica nel richiedere il contributo di prodotti genici sia dal DNA nucleare che da quello mitocondriale. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono derivati dal nucleo poiché la trascrizione del mtDNA porta solo alla sintesi di 13 proteine. Poiché i mitocondri comprendono normalmente proteine >1000 coinvolte in diverse vie metaboliche, la biogenesi dell’organello richiede un mezzo strettamente regolato di importazione e assemblaggio di proteine precursori dal citosol nei vari sottocompartimenti mitocondriali per mantenere una corretta stechiometria e ^{funzione12,13}. Le proteine codificate nucleare destinate ai mitocondri normalmente trasportano una sequenza di targeting mitocondriale (MTS) che le indirizza all’organello e facilita la loro localizzazione sub-compartimentale. La maggior parte delle proteine legate alla matrice contengono un MTS N-terminale scissibile, mentre quelle destinate alla membrana mitocondriale esterna o interna di solito hanno domini di targeting ^interni14. Il processo di importazione viene effettuato da una serie di canali diversi che forniscono più strade per l’ingresso ^{nell’organello13}. Il complesso translocase della membrana esterna (TOM) trasporta i precursori dal citosol nello spazio intermembrana, dove sono riconosciuti dal translocase del complesso della membrana interna (TIM). Questo complesso è responsabile dell’importazione di precursori codificati nucleari nella matrice, dove le proteasi scisdono la presequenza di targeting N-terminale. Le proteine destinate alla membrana esterna possono essere inserite direttamente in questa membrana attraverso il complesso TOM, mentre quelle destinate alla membrana interna sono inserite da una proteina TIM, nello specifico TIM22. Dopo la loro importazione, le proteine vengono ulteriormente elaborate da proteasi e chaperoni residenti e spesso si combinano per formare complessi più grandi, come quelli che si trovano nella catena di trasporto degli elettroni.

L’importazione stessa di proteine mitocondriali serve anche come misura della salute mitocondriale, poiché questo processo si basa sulla presenza di potenziale di membrana e una fonte di energia sotto forma di ^ATP15. Ad esempio, quando il potenziale di membrana viene dissipato, la proteina chinasi PINK1 non può essere assorbita dall’organello, e questo porta a segnali di fosforilazione che innescano l’insorgenza della degradazione dell’organello attraverso una via chiamata ^{mitofagia16,17}. In circostanze analoghe, quando l’importazione è ostacolata, la proteina ATF5 non può entrare nell’organello e successivamente trasloca nel nucleo, dove funge da fattore di trascrizione per l’up-regolazione dell’espressione genica ^UPR18,19. Pertanto, la misurazione dell’efficienza dell’importazione di proteine può fornire una visione completa della salute dell’organello, mentre la risposta all’espressione genica può essere utilizzata per indicare il grado di segnalazione retrograda al nucleo.

Nonostante la sua ovvia importanza per la biogenesi dei mitocondri e per la salute cellulare in generale, la via di importazione nei mitocondri dei mammiferi è notevolmente poco studiata. In questo rapporto, descriviamo i passaggi specifici coinvolti nella misurazione dell’importazione di proteine precursori nei mitocondri del muscolo scheletrico e forniamo dati per illustrare la risposta adattativa del sistema di importazione ai cambiamenti muscolari e al disuso, illustrando il contributo dell’importazione proteica alla plasticità adattativa del muscolo scheletrico.