면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

여기에 제공된 프로토콜은 확립된 프로토콜13,14,15,16,17,18,19,20에서 채택되었다. MHC 급 I 및 II 펩타이드의 면역affinity 정제(IP)에 대한 전반적인 절차는 도 1에 도시된다. 사용되는 세포주 및 항체에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 1. 항체와 결합된 구슬(1일차): 항체를 세파로즈 CNBr 활성화 구슬에 결합 참고: 각 새로운 실험에 대한 새로운 솔루션을 준비합니다. 시약 및 솔루션 레시피 목록은 재료 표 및 보조 표 1 을 참조하십시오. 모든 단계는 실온(RT)에서 수행됩니다. 새로운 항체를 사용하는 경우 키 알리쿼트(선택 사항 참조)를 수집하고 쿠마시 블루 염색 SDS-PAGE를 수행하여 결합 효율을 확인합니다(그림 2). 세파로즈 CNBr 구슬 활성화 시료당 80 mg의 세파로즈 CNBr 활성화 비드를 계량하여 15mL 원문 튜브로 옮겨냅니다. 먼저 말린 구슬의 재정지를 용이하게 하기 위해 먼저 1mM HCl 5mL의 5mL와 파이펫을 5회 위아래로 추가하십시오. 그런 다음 원문 튜브를 1mM HCl의 8.5mL를 추가로 채우십시오. 회전기 장치를 사용하여 RT에서 30 분 동안 20 rpm (분당 회전)에서 회전하십시오. RT에서 2 분 동안 200 x g 의 구슬을 원심 분리하고 포부로 상부를 제거하십시오. 500 μL의 커플링 버퍼를 구슬 펠릿에 넣고 새로운 2.0mL 원심분리기 튜브로 옮기고 1.2.2단계를 위해 따로 보관하십시오. CNBr 활성화 구슬에 항체의 결합 새로운 2.0 mL 마이크로센심심분리기 튜브에서 MHC 급 I 또는 II 펩타이드의 절연을 위해 선택된 항체를 준비한다(제조업체가 지정한 농도에 따라). 커플링 버퍼 솔루션으로 1mL로 볼륨을 완료하여 최종 농도2 mg/mL를 얻습니다. RT에서 2 분 동안 200 x g 에서 1.1.4 단계에서 구슬을 원심 분리한 다음 포부로 상퍼를 제거합니다. 활성 구슬을 포함하는 2.0 mL 마이크로센심분리기 튜브에 항체 용액을 추가합니다. (선택 사항) 18 μL(입력)의 알리쿼트(ALIquot)를 취하고, 4배 SDS-PAGE 버퍼의 6μL을 추가하고 즉시 동결합니다. 회전기 장치를 사용하여 120 분 동안 20 rpm에서 1.2.3 단계에서 마이크로 센트 심분리기 튜브를 회전하십시오. 구슬을 200 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상체를 제거합니다. (선택 사항) 상체(언바운드 항체)의 18μL의 알리쿼트(aliquot)를 취하고, 4배 SDS-PAGE 버퍼의 6μL을 추가하고 즉시 동결하십시오. 항체 결합 구슬의 차단 및 세척 1.2.5 단계에서 항체 결합 구슬을 함유하는 마이크로센심분리기 튜브에 0.2M 글리신 1mL을 첨가한다. 회전기 장치를 사용하여 RT에서 60 분 동안 20 rpm에서 회전하십시오. 2 분 동안 200 x g 의 구슬을 원심 분리 한 다음 상체를 제거합니다. PBS(인산염 완충식식염)의 1mL을 추가합니다. 2 분 동안 200 x g 의 구슬을 원심 분리 한 다음 상체를 제거합니다. (선택 사항) 상체의 18 μL (바운드되지 않은 항체, 마지막 세척)의 알리쿼트 (언바운드 항체, 마지막 세척)를 가져 와서 4 x SDS PAGE 버퍼6 μL을 추가하고 즉시 동결하십시오. 1.3.3 단계에서 비즈에 PBS 1mL을 추가합니다. (선택 사항) 18 μL의 구슬 혼합물(항체와 결합된 구슬)의 알리쿼트(항체와 결합된 구슬)를 넣고, 4x SDS-PAGE 버퍼의 6μL을 추가하고 즉시 동결하십시오. 같은 날 2.5단계에서 사용할 때까지 4°C로 유지하십시오.참고: 비드는 면역 포획 전날 에 준비될 수 있지만 더 긴 저장은 테스트되지 않았습니다. 2. 항체 결합 구슬을 가진 세포 용해 및 면역 포획 (1 일) 참고: MHC 분자의 수준은 한 세포 유형에서 다른 세포 유형으로 다양하며 세포당 MHC/HLA 분자의 정량화가 제안됩니다21(도 4A). 각 IP에 대해 최소 1 x 108 셀을 권장합니다. 이 세포 수는 JY, EL4 및 A20 세포로부터 0.5% Chaps 버퍼로 용해된 단백질6-10 mg에 해당합니다. IP를 위한 세포 펠릿을 준비하기 위하여는, 세포는 PBS의 5 mL로 두 번 세척하고, 원심분리하고, 세척되어야 합니다. 이어서, 세포 펠릿은 IP의 시간까지 -80°C에서 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브 또는 15mL 원문관에 저장될 수 있다. IP는 신선한 수확 또는 냉동 셀 펠릿에서 수행 될 수 있습니다. MHC 급 I 또는 II 펩티드를 분리하려면 손바닥으로 튜브의 바닥을 따뜻하게하여 1 x 108 세포의 냉동 펠릿을 해동하십시오. 서스펜션이 균일해질 때까지 500μL의 PBS를 펠릿과 파이펫에 위아래로 추가합니다.참고: 세포 유형에 따라 셀 펠릿 부피가 크게 달라질 수 있습니다. PBS의 500 μL이 셀 펠릿을 용해하기에 충분하지 않은 경우, 세포가 위아래로 파이펫을 하는 동안 쉽게 분해될 때까지 더 많은 PBS를 사용하십시오. PBS에서 재중단된 펠릿의 총 부피를 측정하고 새로운 튜브 2 mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다. 필요한 경우 더 많은 튜브로 분할합니다. 이전 단계에서 측정된 PBS에서 재연된 세포 펠릿의 부피와 동등한 세포 용해 버퍼(프로테아제 억제제가 함유된 PBS의 1% chaps 버퍼, 1펠릿/10mL 버퍼)를 추가합니다. 리시스 버퍼의 최종 농도는 0.5%입니다. 회전기 장치를 사용하여 4 °C에서 60 분 동안 10 rpm에서 회전하십시오. 원심분리기 는 4°C에서 20분 동안 18,000 x g 에서 최대 브레이크를 적용하고 새로운 2.0mL 마이크로센심분리기 튜브에서 슈퍼나탄트(MHC-펩티드 복합체 포함)를 이송한다. 항체 결합 구슬을 2분 동안 200 x g 에서 원심분리로 1.3.7 단계에서 회수하고 상체를 제거한다. 세포 용액 상체를 항체 결합 구슬에 2.4 단계로 옮기고 회전기 장치를 사용하여 4°C에서 14-18h(하룻밤)에 대한 회전(10 rpm)으로 배양한다. 3. MHC 펩티드의 용출 (2 일) 참고: 폴리프로필렌 컬럼은 비드를 컬럼으로 유지하면서 MHC-펩타이드 복합체를 용출할 수 있습니다. 1% TFA(트리플루오로아세트산)로 산성 용출 전후구구에 경계하는 MHC-펩타이드 복합체의 비율을 평가하기 위해 프로토콜 중 주요 단계에서 취한 알리쿼트와 함께 서부 블롯을 수행할 수 있다(선택 사항 표시 참조). 도 3 에 도시된 서양 블로팅은 1% TFA로 산성 용출에 따른 MHC-펩티드 복합체의 농축을 나타낸다. 이 분획에 신호가 없으면 용출 단계가 성공하지 않았음을 나타냅니다. 비드에 대한 언바운드 MHC-펩티드 복합체의 비율은 또한 3.1.6 단계에 기재된 알리쿼트를 사용하여 서양 블로팅에 의해 병렬로 평가될 수 있다. 항체 결합 구슬에서 MHC 펩티드 복합체의 용출 폴리프로필렌 컬럼의 아래쪽 뚜껑을 제거하고, 열을 폴리프로필렌 기둥 랙에 놓고, 아래에 빈 용기를 설치하여 흐름을 수집합니다.참고: 샘플당 하나의 열이 필요합니다. 10mL의 완충A로 폴리프로필렌 컬럼을 헹구고 중력에 의해 배수합니다. 액체 용출의 유속이 너무 느리면 폴리 프로필렌 컬럼의 바닥 끝을 더 잘라냅니다. 2.5단계에서 구슬-리자이혼합물(~2mL)을 측정하고 수집하여 폴리프로필렌 컬럼으로 옮기습니다. (선택 사항) 서쪽 블로팅을 위해 20 μL(또는 총 부피 중 1/100)의 알리쿼트(또는 총 부피 중 1/100)를 받아서 즉시 동결하십시오. 이 분획은 구슬로 배양된 총 MHC-펩타이드 복합체에 해당한다. 액체 혼합물을 중력에 의해 엘로트하자. (선택 사항) 흐름을 수집하고 측정하고 서쪽 블로팅을 위해 20 μL (또는 총 부피 중 1/100)의 알리쿼트 (또는 총 부피 중 1/100)를 받아 즉시 동결하십시오. 이 분획은 잔류 결합되지 않은 MHC-펩티드 복합체를 나타낸다. 구슬-리자테 혼합물을 가능한 한 많이 회수하려면, 3.1.3 단계에서 1mL의 완충A로 튜브를 헹구고 폴리프로필렌 컬럼으로 옮김한다. 버퍼 A의 10 mL을 추가하여 폴리 프로필렌 열에 유지 구슬을 세척합니다. 세탁 버퍼는 중력에 의해 엘루트하자. 완충 B 10mL, 완충A 10mL, 완충C 10mL로 세척 단계를 반복한다. 랙에서 폴리프로필렌 컬럼을 제거하고 새로운 2.0mL 마이크로센트심분리기 튜브 위에 놓습니다. 기둥과 튜브를 손으로 함께 잡습니다. 폴리프로필렌 컬럼에 1% TFA의 300 μL을 추가하고 5번 위아래로 파이프를 사용하여 구슬을 섞습니다.참고: 비드는 폴리프로필렌 컬럼에 보관되며, MHC 바운드 펩타이드는 2.0mL 마이크로센트심분리기 튜브에서 엘루트됩니다. 새로운 2.0 mL 마이크로센심분리기 튜브에서 용출을 전송합니다. 반복 단계 3.1.11 및 풀 2 용출 (MHC-펩티드 복합체를 포함하는 용출은 총 600 μL에 대응해야하며 단계 3.2.4에서 사용됩니다). (선택 사항) 서쪽 블로팅을 위해 6 μL(또는 총 부피의 1/100)의 알리쿼트(또는 총 부피의 1/100)를 수집하여 즉시 동결합니다. 이 분획은 구슬에서 출루된 MHC-펩티드 복합체에 해당한다. MHC 펩타이드의 탈염 및 용출참고: MHC 펩티드 단계의 탈염 및 용출은 2.0 mL 마이크로 센트리슈후지 튜브에 C18 컬럼을 설치하여 수행 될 수 있습니다. 더 잘 맞도록 C18 컬럼과 2.0 mL 마이크로센심분리기 튜브 사이에 제조업체에서 제공하는 절전 프로그램을 설치하십시오. 이 프로토콜에서 C18 컬럼은 5-200 μL(6-60 μg)의 부피 용량과 함께 사용됩니다. 모든 단계는 RT에서 수행됩니다. C18 열 위에 메탄올 200 μL을 추가한 다음 원심분리기는 1546 x g 에서 3분 동안 추가합니다. 흐름을 삭제합니다. C18 열 위에 80N(아세토닐릴)/0.1%TFA의 200 μL을 추가한 다음 원심분리기는 1546 x g 에서 3분 동안 추가합니다. 흐름을 삭제합니다. C18 열 위에 0.1%TFA의 200 μL을 추가한 다음 원심분리기는 1546 x g 에서 3분 동안 추가합니다. 흐름을 삭제합니다. C18 컬럼 위에 3.1.12 단계로부터 MHC-펩타이드 복합체의 200 μL을 적재한다. 원심분리기는 1546 x g 에서 3분 동안 흐르고 흐름을 버립니다. 전체 볼륨이 로드될 때까지 3.2.4 단계를 두 번 반복합니다. MHC 펩타이드는 C18 컬럼에 유지됩니다. C18 열에 0.1%TFA의 200 μL을 추가한 다음 원심분리기는 1546 x g 에서 3분 동안 추가합니다. 흐름을 삭제합니다. C18 컬럼을 새로운 2.0mL 마이크로센심분리기 튜브로 전송합니다. 28N/0.1%TFA의 150 μL을 추가하여 C18 컬럼에서 엘루트 MHC 펩티드. 원심 분리기 1546 x g 에서 3 분 동안. 새로운 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에서 흐름을 전달합니다. 흐름을 버리지 않도록 주의하십시오. 그것은 절연 된 MHC 클래스 I 또는 II 펩티드를 포함합니다. 총 부피 450 μL에 대해 3.2.7-3.2.9를 두 번 반복합니다. 샘플이 LC-MSMS에 의해 분석될 때까지 -20°C에서 용출액(정제 된 MHC 급 I 또는 II 펩타이드)의 450 μL을 동결한다. LC-MS/MS 분석에 앞서, 3.2.11 단계로부터 정제된 MHC 급 I 또는 II 펩타이드는 2h, 진공 레벨: 100 mTorr 및 진공 램프에 대한 45°C의 사전 셋을 사용하여 건조로 증발된다.참고: 냉동 시료의 증발은 매우 효율적입니다. 말린 펩타이드는 분석될 때까지 재냉동할 수 있다. 4. LC-MS/MS에 의한 MHC 급 I 및 II 펩티드 식별 참고: 고성능 궤도랩및 고해상도 쿼드러폴 시간 질량 분광기6를 사용하여 MHC 급 I 및 II 면역펩티돔을 분석합니다. 다음 정보는 다양한 기존 탠덤 질량 분석 기체가 다른 운영 표준에 따라 작동한다는 점을 고려하여 표시로만 제공됩니다. 단계의 간략한 개요는 다음과 같습니다. 건조된 시료(3.2.12단계로부터)를 4%의 포믹산(FA)의 50μL에서 용해한다. 각 시료에 대해 16μL의 3개의 주사를 적재하고 집에서 만든 반전 상 열(150-μm i.d.by 250mm 길이, 목성 3 μm C18 300 Å)에 분리하고 5%-30% ACN-0.1% FA및 나노 UH-UH흐름에 600nL/min 유동률을 갖는다. 120000의 해상도로 각 전체 MS 스펙트럼을 획득, 최대 3s의 가장 풍부한 곱배음 전구체 이온에 탠덤-MS (MS-MS)를 사용하여 주입 시간 및 스펙트럼을 위한 자동 모드와 4 x 105 의 AGC.참고: 탠덤-MS 실험은 충돌 에너지 30%, 해상도 30,000, AGC 1.5 x 105, 300ms의 주입 시간을 사용하여 고에너지 충돌 해리(HCD)를 사용하여 수행됩니다. 마우스 및 인간 데이터베이스(UniProtKB/Swiss-Prot(2019_09)를 사용하여 프로테오믹스 LC-MS/MS 분석 소프트웨어(예: PEAKS X)를 사용하여 세 개의 주사/샘플에서 데이터 파일을 처리합니다. 효소 매개 변수에 대한 ‘불특정 효소 소화’를 선택하고, 전구체 및 단편 이온에 대한 질량 내성은 각각 10 ppm 및 0.01 Da를 선택합니다.참고: 가변 수정은 탈아미디션(NQ) 및 산화(M)입니다. 다른 모든 검색 매개 변수는 기본 값입니다. 최종 펩티드 목록은 80%의 ALC를 사용하여 필터링되며, 프로테오믹스 LC-MS/MS 분석 소프트웨어를 사용하여 1%의 거짓 발견률(FDR)을 사용합니다. 5. 면역 펩티도믹스 데이터의 시각화 참고: MS에 의해 생성된 면역펩티도믹스 데이터의 품질은 최근에 설명된 바와 같이 여러 가지 방법으로 평가될 수 있다22,23. 데이터를 시각화하고 전반적인 품질, 구성 및 MHC 특이성을 평가하기 위해 MHcVizPipe(MVP) 소프트웨어 도구를 사용할 수 있습니다. 모든 지침 및 관련 문서를 따라 Caron Lab GitHub website24에서 사용할 수 있는 MVP 소프트웨어를 설치하고 실행하십시오.참고: MVP는 샘플 품질, 구성 및 MHC 특이성에 대한 신속하고 통합된 보기를 제공합니다. MVP는 잘 확립된 면역펩티도믹스 알고리즘(NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 및 GibbsCluster27)의 사용을 병렬화하고 HTML(하이퍼텍스트 마크업 언어) 형식으로 체계적이고 이해하기 쉬운 보고서를 생성합니다. 보고서는 완전히 휴대 가능하며 최신 웹 브라우저가있는 모든 컴퓨터에서 볼 수 있습니다. HTML 보고서의 예는 보충 데이터 1-4를 참조하십시오.