미세 유체 장치를 사용하여 siRNA로드 지질 나노 입자의 생산

1. iLiNP 장치의 제조 참고: iLiNP 장치는 표준 소프트 리소그래피 방법을 사용하여 제조된다18. 상세한 제조 프로토콜은 이전에보고되었다10,13. SU-8 금형 제작 SU-8 3050을 3인치 실리콘 웨이퍼에 붓습니다. 실리콘 웨이퍼를 스핀 코팅하여 100 μm 두께의 SU-8 층을 얻습니다. 실리콘 웨이퍼를 65°C에서 5분 동안, 95°C에서 45분간 구워줍니다. 베이킹 후 데스크탑 마스크리스 리소그래피 시스템의 무대에 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. 실리콘 웨이퍼를 365 nm에서 UV 광에 노출하여 1.5s에 1.5s로 한 위치당 노출합니다.참고: 이 실험에서 데스크톱 마스크리스 리소그래피 시스템이 사용되었습니다. 시스템은 마이크로채널의 분할조사 영역(한 위치)에서 UV 광을 자동으로 노출합니다. UV 조사 후, 핫플레이트에 실리콘 웨이퍼를 1분 동안 65°C, 95°C에서 5분간 굽습니다. 실리콘 웨이퍼를 식힌 다음 SU-8 개발자에게 15분 간 담그고 노출되지 않은 SU-8을 제거합니다. 건조기와 진공 펌프를 사용하여 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)의 SU-8 금형을 시란으로 처리합니다. iLiNP 장치의 제조 실리콘 베이스와 폴리디메틸실록산(PDMS) 경화제를 10:1 비율로 혼합한다(w/w). 진공 펌프와 건조기로 혼합물을 탈가스합니다.참고: PDMS는 실온에서 10분 동안 진공 펌프를 사용하여 탈유되었습니다. 탈가스 PDMS를 SU-8 몰드에 최대 0.5~1cm 두께의 페트리 접시에 넣고 80°C에서 1시간 동안 오븐에서 굽는다. 금형을 식힌 다음 트위저를 사용하여 SU-8 금형에서 PDMS 기판을 벗깁니다. PDMS 기판에 3개의 구멍(0.5 mm)을 펀치합니다. iLiNP 장치를 구축하기 위해 산소 플라즈마 클리너를 사용하여 PDMS 기판 및 유리 슬라이드를 결합합니다( 그림 1)13을 참조하십시오. 3개의 PEEK 모세혈관(I.D. 0.3 mm, O.D. 0.5 mm)을 iLiNP 장치의 입구 및 콘센트에 연결하고 슈퍼 접착제로 치료합니다.참고: PEEK 모세혈관의 길이는 조절이 가능하며 실험에 따라 다릅니다. 2. 지질 솔루션 준비 지질/에탄올 용액 준비: 13.4 mM 1-팔미토일-2-올레오일-센-글리케로-3-인포콜린(POPC), 10mMM 1,2-디스테로일-sn-글리케로-3-인포콜린(DSPC), 2 0 mM 1,2-디오틸록시-3-트리메틸람모늄 프로판(DOTAP), 5mM 1,2-디미리스토틸-락 글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2k), 및 20mM 콜레스테롤. 실험 전에 재고 용액을 -20°C로 저장합니다. siRNA로드 LP를 생산하려면 DOTAP, DSPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2k 용액을 50/10/38.5/1.5의 어금니 비율로 혼합하십시오. 총 지질 농도는 8mM로 조정된다. 3. 수성 솔루션 준비 수성 용액 준비: 154 mM NaCl (식염수), 25 mM 아세테이트 버퍼 pH 4.0 DNase/RNase 프리 증류수를 사용 하 여. 0.2 μm 크기의 멤브레인 필터 또는 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다. 4. siRNA/버퍼 용액 의 준비 siGL4 70 μg를 25m 아세테이트 버퍼(pH 4.0)의 1mL로 녹입니다.참고: siGL4는 루시파아제 유전자의 녹다운에 사용됩니다. 5. iLiNP 장치 설정 및 LP 생산 참고: 회로도의 그림 1 을 참조하십시오. 지질 및 수성 솔루션(개별 주사기의 경우 3.1 및 4.1 단계)으로 1mL 유리 주사기를 각각 채웁니다.참고: LNP 평가 실험에 필요한 양에 따라 지질 및 수성 용액 량을 조정합니다. 유리 주사기를 주사기 커넥터를 사용하여 PEEK 모세혈관에 연결합니다. 지질 및 수성 솔루션의 유량을 설정합니다.참고: 수성상에서 지질상까지의 유량 비율(FRR)은 3:1에서 9:1까지 다양합니다. 주사기 펌프를 사용하여 iLiNP 장치에 지질 및 수성 용액을 별도로 도입합니다. iLiNP 장치의 콘센트에서 마이크로튜브에서 LNP 서스펜션을 수집합니다(그림 1). 6. LNP 서스펜션 및 LNP 크기 측정의 투석 POPC LP 및 siRNA 로드 LP에 대한 식염수 또는 D-PBS에 대해 하룻밤 사이에 4°C에서 투석 막(12-14 kDa MW 컷오프)을 사용하여 LNP 서스펜션을 투석한다.참고 : POPC는 식염수로 용해되지 않습니다 (2.1 참조하시기 바랍니다). POPC/에탄올 용액은 iLiNP 장치에서 식염수로 희석된다. 마이크로튜브에서 투석된 LNP 서스펜션을 수집합니다. 마이크로 쿼츠 셀에 LNP 서스펜션의 파이펫 20-30 μL. 동적 광 산란(DLS)을 통해 LNP 크기, LNP 크기 분포 및 다분산지수를 측정합니다. 7. LNP의 Z 잠재력 측정 참고: Z-잠재력을 측정하기 위해 제조업체의 지시에 따라 입자 분석기( 재료 표 참조)가 사용되었습니다. 10mM HEPES 버퍼(pH 7.4)로 6.1, 35배에서 얻은 LNP 서스펜션을 희석시켰다. 파이펫 700 ~ 1000 μL의 희석된 LNP 현탁액은 모세관 세포로 한다. 제조업체의 지시에 따라 Z 가능성을 측정합니다. 8. 리보그린 분석에 의한 siRNA 캡슐화 효율 참고: 리보그린 분석은 LNPs19로 의 siRNA 캡슐화를 평가하기 위해 수행됩니다. 리보그린 분석은 계면활성제(예: TritonX-100)가 있는 LP 내부 및 외부의 RNA 양을 측정할 수 있습니다. 10m HEPES 버퍼(pH 7.4)에서 500 ng/mL siGL4 용액으로 2 mg/mL을 희석시합니다. 트리톤(+) 및 트리톤(-) 샘플에 대한 교정 곡선을 만들기 위해 siGL4 솔루션의 희석 계열(0, 12.5, 25, 50, 100, 200 ng/mL)을 준비한다. LNP 서스펜션을 10m HEPES 버퍼(pH 7.4)로 100회 희석합니다. 트리톤(+) 용액에 대해 다음을 혼합합니다: 10mHEPES(pH 7.4)의 980 μL, 10%의 μL w/v TritonX-100, 리보그린 1.25 μL 1.25 μL 96웰 마이크로플레이트의 10웰. 트리톤(-) 용액을 혼합합니다: 10mHEPES의 1000 μL(pH 7.4) 및 리보그린의 1.25 μL은 96웰 마이크로플레이트의 10개의 웰에 대해 이렇게 한다. 파이펫 100 μL 의 희석 계열의 siGL4 용액과 희석 LNP 서스펜션은 블랙 96웰 마이크로 플레이트의 우물에 들어갔다.참고: siGL4 용액희석 시리즈와 희석 된 LNP 서스펜션은 조건당 4 개의 마이크로웰로 분배되었습니다. 검출 용액(TritonX-100(+) 또는 트리톤(-)의 파이펫 100 μL이 우물안으로 들어갑니다.참고: 검출 용액(TritonX-100(+)은 조건당 샘플당 2개의 우물로 분배되었고, TritonX-100(-) 용액은 샘플 조건당 나머지 두 개의 우물에 분배되었다. 실온에서 5분 동안 마이크로플레이트를 배양합니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 475 nm의 파장을 사용하여 형광 강도를 측정합니다. 다음 방정식19로부터 siRNA 캡슐화 효율을 계산한다. 9. 세포 배양 DMEM, 열 불활성 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 연쇄절제술, 400μg/mL G418을 포함하는 성장 매체를 준비한다. 배양 HeLa 세포는 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 성장 배지를 함유하는 100mm TC 처리세포 배양식에서 반딧불및 레닐라 루시파라제(HeLa-dluc)를 안정적으로 표현한다. 10. 셀 생존 가능성 분석 종자 100 μL의 성장 배지에서 HeLa 세포의 현탁액(6 x 103 세포/웰) 96웰 마이크로 플레이트.참고: 세포는 세포 카운터 플레이트와 현미경을 사용하여 계산되었습니다. 마이크로 플레이트를 37°C에서 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다. 10 및 100 nM siRNAs의 농도에서 DMEM (-)으로 siRNA로드 LN을 희석시 희석시. 희석된 siRNA 로드 LNP 서스펜션의 100 μL을 양호한 것으로 분배한다. 마이크로 플레이트를 37°C에서 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다. LNP 서스펜션을 제거하고 DMEM(FBS(+)의 100 μL을 추가합니다. 마이크로 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 키트를 사용하여 셀 생존 가능성을 측정합니다.참고: D-PBS(-)는 음수 제어로 사용되었다. 11. 루시파라제 유전자 녹다운 분석 종자 75 μL성장 배지에서 HeLa 세포의 현탁액(4.5 x 103 세포/웰) 96웰 마이크로 플레이트. 마이크로 플레이트를 37°C에서 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다. 10 및 100 nM siRNAs의 농도에서 DMEM (-)으로 siRNA로드 LN을 희석시 희석시. 희석된 siRNA 로드 LNP 서스펜션의 75 μL을 1개당 잘 분배합니다. 마이크로 플레이트를 37°C에서 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다. LNP 서스펜션을 제거하고 75 μL의 DMEM(FBS(+)을 추가합니다. 마이크로 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 키트를 사용하여 루시파라제 식을 측정합니다.참고: D-PBS(-)를 음수 제어로 사용했습니다.