使用微流体装置生产siRNA负载的脂质纳米颗粒
概要
基于微流体的脂质纳米颗粒（LNP）生产方法在药物递送系统（DDS）中引起了人们的关注，包括RNA递送。该协议描述了使用我们名为iLiNP的原始微流体装置的制造，LNP（siRNA负载LNP）生产和LNP评估过程。
Abstract
功能性脂质纳米颗粒（LNPs）的开发是药物输送系统（DDS）领域的主要挑战之一。最近，基于LNP的RNA递送系统，即RNA负载的LNP引起了RNA治疗的关注。特别是，mRNA负载的LNP疫苗被批准用于预防COVID-19，从而导致向下一代纳米药物开发的范式转变。对于基于LNP的纳米药物，LNP大小是控制LNP生物分布和LNP性能的重要因素。因此，精确的LNP尺寸控制技术对于LNP生产过程是必不可少的。在这里，我们报告了一种使用名为iLiNP的微流体装置进行尺寸控制的LNP生产的协议。使用iLiNP装置生产siRNA负载的LNP，并通过 体外 实验进行评估。LNP大小显示出具有代表性的结果，包括siRNA负载的LNP，Z电位，siRNA封装效率，细胞毒性和靶基因沉默活性。
Introduction
脂质纳米颗粒（LNP）是RNA递送系统中使用最广泛的纳米载体之一。最近，mRNA负载的LNP已被批准作为预防COVID-191，2，3的疫苗。通常，LNP的大小在生物分配和药物递送系统（DDS）性能中起着至关重要的作用，包括基因沉默或蛋白表达4，5，6。因此，LNP生产过程需要精确的LNP尺寸控制方法。
对于尺寸受控LNP的生产，微流体装置多年来引起了人们的关注7。2018年，第一个美国食品和药物管理局（FDA）批准的siRNA负载LNP（例如Onpattro）使用微流体装置8，9开发。在基于微流体的LNP生产方法中，将脂溶液和水溶液分别引入微流体装置中，然后在微通道中混合。为了提高混合效率，混沌混合器装置已用于LNP生产10，11，12。混沌混频器装置可以生产特定尺寸的LNP。
已经开发了一种简单的微流体装置，称为侵入性脂质纳米颗粒生产（iLiNP），配备挡板结构，以精确控制LNP尺寸13，14。与混沌混频器器件相比，iLiNP器件能够以10 nm的间隔控制LNP尺寸范围为20~100 nm。此外，iLiNP装置还产生了siRNA负载的LNPs6，mRNA加载的LNPs15，核糖核蛋白加载的LNP16和外泌体样LNP17。本文旨在介绍iLiNP器件的制备和siRNA负载LNP生产工艺，并描述iLiNP器件生产的LNP评价过程。
Protocol
1. iLiNP器件的制造 注：iLiNP器件采用标准软光刻法制造18。详细的制造协议之前已报道过10，13。 SU-8模具制造 将SU-8 3050倒入3英寸硅晶圆上。旋转涂覆硅片以获得100μm厚的SU-8层。 通过将硅晶片放在65°C的加热板上5分钟，95°C烤45分钟。 烘烤后，将硅晶圆放在桌面无掩模光刻系统的舞台上。 将硅晶圆暴露在365 nm的紫外光下，每个位置1.5秒。注：本实验使用了台式无掩模光刻系统。该系统自动将紫外线暴露在微通道的分割照射区域（一个位置）。 紫外线照射后，在65°C的电炉上烘烤硅片1分钟，95°C烘烤5分钟。 冷却硅晶圆，然后在SU-8显影剂中浸泡15分钟以除去未暴露的SU-8。 使用干燥器和真空泵处理含三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷的SU-8模具。 iLiNP器件的制造 将有机硅基和聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 固化剂以 10：1 的比例（w/w）混合。 使用真空泵和干燥器对混合物进行脱气。注：PDMS在室温下使用真空泵脱气10分钟。 将脱气的PDMS倒入100毫米培养皿中的SU-8模具上，厚度可达0.5至1厘米，然后在80°C的烤箱中烘烤1小时。 冷却模具，然后使用镊子将PDMS基材从SU-8模具上剥离。 在 PDMS 基板上打三个孔 （0.5 mm）。使用氧等离子体清洁剂粘合PDMS基板和载玻片，以构建iLiNP器件（见 图1）13。 将三个PEEK毛细管（内径0.3毫米，外径0.5毫米）连接到iLiNP装置的入口和出口，并用超级胶水固化。注意：PEEK毛细管的长度是可调的，取决于实验。 2. 脂质溶液的制备 制备脂质/乙醇溶液：13.4 mM 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC），10 mM 1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC），20 mM 1，2-二油酰氧基-3-三甲基丙烷（DOTAP），5 mM 1，2-二聚甲酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2k）和20 mM胆固醇。在实验前将储备溶液储存在-20°C。 为了产生siRNA负载的LNP，以50/10/38.5/1.5的摩尔比混合DOTAP，DSPC，胆固醇和DMG-PEG2k溶液。将总脂质浓度调节至8mM。 3. 水溶液的制备 制备水溶液：154 mM NaCl（盐水），25 mM醋酸缓冲液，pH 4.0，使用不含DNase / RNase的蒸馏水。 通过0.2μm尺寸的膜过滤器或注射器过滤器过滤溶液。 4. siRNA/缓冲液的制备 将70μgsiGL4溶解到1mL的25mM醋酸缓冲液（pH 4.0）中。注意：siGL4用于敲低荧光素酶基因。 5. iLiNP装置的设置和LNP的生产 注：原理图见 图1 。 用脂质和水溶液填充1 mL玻璃注射器（分别在单个注射器中从步骤3.1和4.1开始）。注意：根据LNP评估实验所需的量调整脂质和水溶液体积。 使用注射器连接器将玻璃注射器连接到PEEK毛细管。 设置脂质和水溶液的流速。注：水相与脂相的流速比（FRR）范围为3：1至9：1。 使用注射泵将脂质和水溶液分别引入iLiNP设备。 从iLiNP设备的出口收集微管中的LNP悬浮液（图1）。 6. LNP悬浮液的透析和LNP尺寸测量 使用透析膜（12-14 kDa MW截止值）在4°C下对盐水或D-PBS分别对POPC LNPs和siRNA负载的LNP进行透析。注意：POPC不会溶解到盐水中（请参阅2.1）。POPC/乙醇溶液在iLiNP装置中用盐水稀释。 在微管中收集透析的LNP悬浮液。 将20-30μLLLL悬浮液移液到微石英池中。 通过动态光散射 （DLS） 测量 LNP 大小、LNP 大小分布和多分散性指数。 7. LNP Z电位的测量 注：为了测量Z电位，按照制造商的说明使用了粒子分析仪（见 材料表）。 用10mM HEPES缓冲液（pH 7.4）稀释从步骤6.1获得的LNP悬浮液35次。 将700至1000μL稀释的LNP悬浮液移液到毛细管细胞中。 根据制造商的说明测量 Z 电位。 8. 硅氧核糖苷酸包封效率 注意：进行核糖绿测定以评估siRNA包封成LNPs19。Ribogreen测定可以测量LNP内部和外部的RNA的量，使用/不使用表面活性剂（例如，TritonX-100）。 用10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）稀释2mg / mL siGL4至500 ng / mL siGL4溶液。 制备siGL4溶液的稀释系列（0，12.5，25，50，100，200 ng / mL），以制作Triton（+）和Triton（-）样品的校准曲线。 用10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）稀释LNP悬浮液100次。 对于Triton（+）溶液，混合以下内容：980μL10mM HEPES（pH 7.4），20μL10%w / v TritonX-100和1.25μLRiboGreen用于96孔微孔板的10孔。 将以下溶液混合用于Triton（-）溶液：1000μL10mM HEPES（pH 7.4）和1.25μLRiboGreen，用于96孔微孔板的10孔。 将100μL稀释系列的siGL4溶液和稀释的LNP悬浮液移入黑色96孔微孔板的孔中。注意：将siGL4溶液和稀释的LNP悬浮液的稀释系列分配到每个条件的四个微孔中。 将100μL检测溶液（TritonX-100（+）或Triton（-））移入孔中。注意：检测溶液（TritonX-100 （+））在每个条件下将每个样品分配到两个孔中，并且每个样品条件将TritonX-100（-）溶液分配到剩余的两个孔中。 在室温下孵育微孔板5分钟。 使用波长为475nm的酶标仪测量荧光强度。 根据以下等式计算siRNA封装效率19。 9. 细胞培养 准备含有DMEM，热灭活的10S，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素和400μg/ mL G418的生长培养基。 在含有生长培养基的100mm TC处理的细胞培养皿中稳定表达萤火虫和Renilla萤光素酶（HeLa-dluc）的HeLa细胞在5%CO 2 培养箱中在37°C下培养。 10. 细胞活力测定 在96孔微孔板中将100μLHeLa细胞悬浮液接种在生长培养基（6×10 3 个细胞/孔）中。注意：使用细胞计数器板和显微镜对细胞进行计数。 将微孔板在37°C下在5%CO 2培养箱中孵育24 小时。 用 DMEM （FBS （-）） 以 10 和 100 nM siRNA 的浓度稀释 siRNA 负载的 LNP。 每孔分配100μL稀释的siRNA负载LNP悬浮液。 将微孔板在37°C下在5%CO 2 培养箱中孵育4小时。 取出LNP悬浮液并加入100μLDMEM（FBS（+））。 将微孔板在37°C下在5%CO 2培养箱中孵育20 小时。 根据制造商的协议，使用市售试剂盒测量细胞活力。注：D-PBS（-）被用作阴性对照。 11. 荧光素酶基因敲低试验 在96孔微孔板的生长培养基（4.5×10 10 3 个细胞/孔）中接种75μLHeLa细胞悬浮液。 将微孔板在37°C下在5%CO 2培养箱中孵育24 小时。 用 DMEM （FBS （-）） 以 10 和 100 nM siRNA 的浓度稀释 siRNA 负载的 LNP。 每孔分配75μL稀释的siRNA负载LNP悬浮液。 将微孔板在37°C下在5%CO 2 培养箱中孵育4小时。 取出LNP悬浮液并加入75μLDMEM（FBS（+））。 将微孔板在37°C下在5%CO 2培养箱中孵育20 小时。 根据制造商的协议，使用市售试剂盒测量荧光素酶表达。注意：我们使用D-PBS（-）作为阴性对照。
Representative Results
图2A、B 显示了在不同流动条件下产生的POPC LNP尺寸分布。基于微流体的LNP制备方法可以通过总流速（TFR）和FRR等流动条件来控制LNP的大小。与典型的微流体器件（包括混沌混合器器件和流量聚焦微流体器件）相比，iLiNP器件可实现20至100 nm的精确LNP尺寸控制（图2）。在高总流速条件下形成小尺寸LNP。此外，无论总流速如何，在 FRR 为 5 时形成的 LNP 尺寸都小于 FRR 为 3 的 LNP 尺寸13。 还使用iLiNP装置制备了siRNA负载的LNP（图3A）。对于siRNA负载的LNP制备，使用DOTAP（一种阳离子脂质）有效地将siRNA封装到LNP中。iLiNP器件产生90nm大小的siRNA负载阳离子LNP，分布窄（图3A，B）。由于阳离子脂质和带负电荷的siRNA之间的静电相互作用，siRNA封装效率为95%（图3C）。 评估了90 nm大小的siRNA负载LNP的细胞毒性和基因沉默活性， 如图4 和 图5所示。siRNA加载的LNP在10和100 nM siRNA的剂量下确实显示出细胞毒性。我们还证实，荧光素酶的表达水平根据siRNA浓度而降低。siRNA负载的LNP在100 nM siRNA的剂量下抑制了80%的荧光素酶表达。LNP大小对基因沉默活性的影响已有报道6，13，17。 图1：（A）iLiNP器件的示意图和（B）照片。 iLiNP 器件由 PDMS 和玻璃基板组成。iLiNP设备通过超级胶水连接到PEEK毛细管。使用注射泵将脂质和siRNA/缓冲液分别引入iLiNP设备。LNP悬浮液被收集在微管中。 请点击此处查看此图的放大版本。 图 2：iLiNP 设备在不同流速比 （FRR） 下产生的 POPC LNP 尺寸分布。 POPC LNP 大小通过动态光散射 （DLS） 进行测量。POPC LNP是通过改变总流速和FRR来制备的：（A）3 FRR和（B）5 FRR。在高总流速条件下形成小尺寸LNP。此外，在FRR为5时形成的LNP规模小于在FRR为3时形成的规模。 请点击此处查看此图的放大版本。 图3：siRNA负载LNP的表征。 （A）siRNA负载LNP的大小分布，siRNA（siGL4）通过阳离子脂质（DOTAP）和带负电荷的siRNA之间的静电相互作用封装到LNP中。（B）siRNA负载的LNP的Z电位。在测量之前，用10mM HEPES缓冲液（pH 7.4）稀释LNP悬浮液。数据表示为均值± SD（标准差）。 n = 3。（三）基于DOTAP的LNP的siRNA包封效率。通过RiboGreen测定法测定了封装效率。数据表示为均值± SD. n = 3。 请点击此处查看此图的放大版本。 图4：siRNA负载的LNP的细胞毒性。 用DMEM（FBS（-））稀释siRNA负载的LNP以获得10和100 nM的siGL4浓度。将LNP悬浮液加入HeLa-dLuc细胞中，并在5%CO 2培养箱中在37°C下孵育4小时。无处理：未经处理（D-PBS（-））。数据表示为 SD ±平均值。请点击此处查看此图的放大版本。 图5：用siRNA负载的LNP处理的荧光素酶基因敲低活性，siRNA加载的LNP的制备方式与细胞活力测定相同。使用双色荧光素酶测定系统测量荧光素酶表达水平。无处理：未经处理（D-PBS（-））。数据表示为 SD ±平均值。请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
LNP大小影响LNP的生物分布、抗肿瘤作用和基因沉默性能。因此，LNP尺寸控制方法是生产DDS纳米药物（包括RNA递送系统）的重要技术。本文旨在介绍用于LNP精确调整尺寸的iLiNP器件及其在siRNA负载LNP生产中的应用。iLiNP器件能够控制LNP尺寸范围为20至100 nm（图2）13。当总流速和FRR等流动条件改变以控制LNP尺寸时，应在约5至10 s后收集LNP悬浮液以稳定溶液流量。从iLiNP装置的出口收集的LNP悬浮液立即对缓冲溶液透析，以除去乙醇并防止LNP聚集。
LNP尺寸控制是DDS领域的主要挑战之一。通常，传统的LNP生产工艺，如脂质膜水合法，在LNP生产后需要一个尺寸调整过程20。另一方面，基于微流体的LNP生产方法可以通过将脂质和水溶液引入微流体装置来生产尺寸受控的LNP6，11，13。虽然透析过程需要从LNP悬浮液中除去乙醇，但微流体装置与切向流系统相结合的连续过程有望实现LNP生产过程的自动化14。文献表明，流量聚焦微流体装置21 和混沌混合器装置的POPC LNP尺寸分别为50-60 nm和30-60 nm10。与其他微流体器件相比，iLiNP器件可在20至100 nm的宽范围内实现POPC LNP尺寸控制。
所采用的iLiNP器件的制造工艺是标准的软光刻。因此，iLiNP器件可以通过快速原型技术批量生产，并通过使用一次性器件防止溶液的交叉污染。iLiNP装置可以以与POPC LNP生产方法相同的方式产生siRNA负载的LNP。对于使用iLiNP器件的LNP生产方法，用户不需要任何复杂的程序。由于这些原因，基于微流体的LNP生产方法，包括iLiNP装置，预计将被用作标准的LNP生产方法。本文的实验方案可适用于LNP生产的其他微流体器件。此外，通过将siRNA/缓冲溶液更改为含有mRNA的缓冲溶液，也可以生产mRNA负载的LNP。
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了JST，CREST授权号JPMJCR17H1，日本，JST，PRESTO授权号JPMJPR19K8，日本JST，SCORE，日本，教育，文化，体育，科学和技术部的特殊教育和研究费用，JSPS KAKENHI授权号JP19KK0140和生谷科学技术基金会的支持。
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | NOF Corp. | MC-6081 | |
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2K) | NOF Corp. | GM-020 | |
| 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP) | NOF Corp. | CL-8181TA | |
| 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinev (DSPC) | NOF Corp. | MC-8080 | |
| 10 x D-PBS (-) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 048-29805 | |
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 017-00251 | |
| CellTiter-Blue Cell Viability Assay | Promega | G8081 | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667-5G | |
| Desktop maskless lithography system | NEOARK CORPORATION | DDB-701-DL4 | |
| Dialysis membrane | Repligen | 132697 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | Lot: 42G6587K | |
| G418 | Nacalai Tesque | 08973-14 | |
| Glass substrate | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S1111 | |
| Glass syringe | Hamilton | GASSTIGHT 1002 | |
| HeLa cell | HeLa-dluc cells were provided from Dr. Yusuke Sato at Hokkaido University | ||
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 342-01375 | |
| Low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | |
| Oxygen plasma cleaner | Femto Science | CUTE-1MP/R | |
| Penicillin–streptomycin, trypsin (2.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | R11491 | |
| siGL4 | Hokkaido System Science Co., Ltd | The sense and antisense strand sequences of siGL4 are 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT -3' and 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT -3', respectively. |
|
| Silicon wafer | GTC | ||
| SILPOT 184 W/C (PDMS) | Dow Corning Toray Co., Ltd. | silicone base and curing agent are included | |
| Sodium acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 192-01075 | |
| Sodium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 191-01665 | |
| SU-8 3050 | Nippon Kyaku Co., Ltd. | ||
| Syringe connector | Institute of microchemical Technology Co., Ltd. | ISC-011 | |
| Syringe pump | Chemyx | CX07200 | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments | ZEN3600 |
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