DUCT：双树脂铸造，然后进行微型计算机断层扫描，用于3D肝脏分析

本研究中描述的协议获得批准，并遵循斯德哥尔摩动物研究伦理委员会（Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd）的动物福利规则和法规。本研究中使用的动物是混合C3H / N和C57bl6J背景上的野生型或纯合Jag1H268Q突变小鼠。男性和女性都包括在研究中。这些动物在出生后第15天或作为3-8个月的成年人使用。 1. 双树脂注射 制备准备树脂溶液。对于双体系树脂注射液，请按照步骤1.1.2-1.1.4中所述准备黄色和绿色树脂。 每只小鼠准备1 mL等分试样的稀释树脂。 黄色树脂：用透明稀释剂以3：1的稀释液稀释黄色硅橡胶（高不透射线性），制备注射用黄色树脂。 绿色树脂：将蓝色硅橡胶（检测不到的不透射线性）与透明稀释剂以1：1稀释混合，制备蓝色树脂。为了生成绿色树脂，将稀释的蓝色树脂与稀释的黄色树脂以1：1的比例混合。彻底涡旋绿色树脂，直到颜色均匀。注：蓝色树脂具有非常低的不渗透力，用microCT无法检测到，因此需要用黄色树脂稀释以产生具有不同不透射线性的两种树脂。注意：树脂可能含有铬酸铅，这是一种致癌物质。它在火灾中产生有毒气体。小心处理，并将树脂作为危险废物处理。 按照步骤 1.1.6-1.1.11 中所述，使用管准备两个注射装置（注射装置 #1 和注射装置 #2）。注意：对于成年小鼠（>P30（产后第30天）= P30 – 2年），使用注射套件#1（PE10管，外径为0.6mm）进行胆总管注射，使用注射套件#2（PE50管，外径为0.96mm）进行门静脉注射。对于年轻的产后小鼠（高达P30），准备两个#1注射套件，一个用于胆管，一个用于门静脉注射（没有注射组#2，因为门静脉太窄而无法容纳PE50管）。 要准备注射套件#1，切下30厘米的PE10管，并通过拉动用手拉伸管子的一端，直到它变得尽可能薄（图1A，B，直径约为0.15毫米，非拉伸PE10管的直径为0.6毫米）。 对角切割拉伸PE10管的尖端，形成斜尖（图1B）。 将PE10管的非拉伸端连接到30 G针（图1A，注射套件#1）。 要准备注射套件#2，切开30厘米的PE50管，并通过拉动用手拉伸管的一端，直到它变得足够薄以适合门静脉（图1A，B，约0.7毫米，非拉伸PE50管直径为0.96毫米）。 对角切割拉伸PE50管的尖端，形成斜尖（图1B）。 将PE50管的非拉伸端连接到23 G针（图1A，注射套件#2）。注意：每个注射套件只能用于一次注射，因为树脂会在注射器和管路中硬化。根据小鼠胆总管和门静脉的大小，根据其年龄，基因型和表型调整拉伸和斜尖的大小。当不确定管道的尺寸和配合时，请在切口之后和管道填充树脂之前将管道插入适当的管道或容器中。如果管道太宽而无法放入管道/容器中，请进一步拉伸。 通过异氟醚吸入麻醉动物（首先在诱导室中4%，使用鼻锥约2%）。 将鼠标放在解剖垫上的通风长凳上，同时鼠标通过鼻锥呼吸异氟醚。通过研究所/ IRB推荐的方法验证动物是否失去知觉，例如，通过捏住其中一只爪子。注意：异氟醚吸入时可能导致嗜睡或头晕，并可能通过长期或反复接触对心血管系统和中枢神经系统造成损害。不要吸入它。在通风的长凳和通风良好的区域处理该物质。注意：可以使用另一种麻醉方法，只要它与心脏灌注相容。 一旦动物失去知觉，用70%乙醇喷洒腹侧，以防止毛皮干扰。 使用皮肤剪刀，从腹腔中线开始切开皮肤，筋膜和肌肉层，然后切入胸腔以暴露内脏。 用镊子抓住腩子，抬起胸骨，切开两侧的横膈膜和肋骨笼，露出心脏和肺部。 用剪刀切开胸腔左侧和右侧的肋骨，取下肋骨笼。格外小心不要损害肝脏，因为这会导致树脂泄漏。 使用直镊子，将心脏拉向肝脏并切除右心房。 将连接到蠕动灌注泵的蝴蝶针（23 G）插入左心室。用Hanks平衡盐溶液（HBSS）和肝素（1 U / g小鼠体重）经心电过灌注小鼠。灌注 3 分钟，灌注速率为 5 mL/分钟。注意：如果正确灌注小鼠，内脏器官会变得苍白，尤其是肝脏。相反，如果肺部变白，则将针头插入右心室，并应重新定位。灌注后，小鼠被外血化，可以从鼻锥和异氟醚中取出。 关闭异氟醚泵。 树脂注射 – 胆道体系树脂浇注将鼠标移动到解剖显微镜，腹部向上，尾巴朝向实验者，然后远离实验者。感兴趣的解剖学标志如图 2A所示。 通过将肠道移动到一侧来定位下腔静脉（图2A）。使用弹簧剪刀在下腔静脉中做一个小的横向切口，以释放肝血管压力（图2Bi）。 暴露胆总管和门静脉，如步骤1.2.4-1.2.6中所述。 使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）润湿的棉签将肠道和胰腺移动到（实验者的）右侧。 使用PBS润湿的棉签将肝脏的腹侧向心脏翻转，以暴露内脏表面和肺门区域。 找到从肺门区域穿过胰腺并进入Oddi括约肌处肠道的胆总管（图2Bii，用黄色虚线勾勒的胆总管，黑色箭头指向Oddi的括约肌）。注意：通过洒上PBS来确保肝脏在整个过程中是湿润的。 使用直镊子从胆总管清除周围组织（面积〜5毫米）。将丝线（尺寸4-0，0.17毫米，3-5厘米长）放在胆总管下方（图2Bii），并在胆总管周围打一个松散的手结（图2Biii）。注意：选择一个区域作为结，位于肺门区域和Oddi括约肌之间的中间区域，并且距离门静脉有一定距离，以便在胆总管周围收紧缝合线后，它不会干扰门静脉注射。 将弹簧剪刀平放在胆总管上，在胆总管进入胰腺和肠的地方，在Oddi括约肌旁边的胆总管上做一个斜切口。（图2Biv），黄色虚线勾勒出Oddi区域的括约肌，用黑色箭头强调）。注意：这是一个关键步骤。做一个斜切而不是横向切口，并做一个切口;不要切断胆管。切割整个胆管使得管道的插入非常具有挑战性。 在使用前，将1 mL黄色树脂与50μL固化剂混合（通过填充和清空1mL注射器），并用树脂 – 固化剂混合物填充1mL Luer注射器。 将填充的注射器与管子（1组）连接。按压柱塞以完全填充管道。确保树脂/固化剂混合从管尖滴落。注意：避免并清除注射器和管路中的气泡，以获得最佳效果。 使用镊子，拉直胆总管切口周围的区域，并将管插入胆总管的开口（图2Bv），斜尖的最长边缘向下朝向胆管的背侧。这种方向确保树脂可以从朝上的管道开口中流出，进入管道（图2Bv）。 拧紧丝线结，将管子固定在胆总管内（图2Bvi）。 将树脂注入胆总管。观察胆囊和单个肝叶。 用PBS润湿的棉签按摩肝脏，以帮助均匀地涂抹树脂。树脂填充的胆管的末端分支（在野生型小鼠中）在肝脏表面隐约可见。注意：预计填充肝脏的时间是30-100秒。 当树脂点出现在肝脏表面（图2Ci，蓝色箭头）或遇到阻力时，停止注射树脂。注意：尽可能快地工作，因为树脂在加入树脂固化剂后开始硬化。添加固化剂的工作时间约为15分钟。 将管子从胆总管中拉出，然后用镊子快速拧紧丝结，以防止树脂泄漏出来。切掉丝线的松散末端，这样它们就不会干扰门静脉注射。 将含有树脂的管路和剩余的树脂处理成危险废物，将针头扔进尖锐的废物中。 树脂注射 – 门脉树脂浇注 使用直镊子从其进入肝脏约2厘米处清除门静脉（面积〜5mm）与周围组织。将丝线（尺寸4-0，0.17毫米，3-5厘米长）放在门静脉的清除区域下（图2Ci），并系上松散的手结（图2Cii）。 在肝脏和结的门静脉远端做一个纵向切口（图2Ciii）。 将1 mL绿色树脂与50μL固化剂混合（通过填充并排空1mL注射器），并用树脂固化剂混合物填充1mL鲁尔注射器。 将填充的注射器与管子连接（>P30小鼠的设置#2，<P30小鼠的新套件#1）。按压柱塞以完全填充管道。确保树脂从管尖滴落。注意：避免并清除注射器和管路中的气泡，以获得最佳效果。 使用镊子，通过将周围组织拉向实验者来拉直门静脉，并将斜尖最长边缘的管子插入血管的背侧（图2Ciii）。 拧紧丝线，将管子固定在门静脉中。 将树脂注入门静脉。观察血管充满树脂。用PBS润湿的棉签按摩肝脏，以帮助均匀地涂抹树脂（图2Civ）。 当所有血管都充满（门静脉的末端在肝边缘可见）或遇到阻力时，停止注射树脂。注意：由于树脂在添加固化剂后开始硬化，因此快速工作。添加固化剂的工作时间对于注射剂#1约为15分钟，对于注射剂组#2约为25分钟。 从门静脉中拉出管子，取出管子，然后用镊子快速拧紧丝结，以防止树脂泄漏出来。 将含有树脂的管路和剩余的树脂处理成危险废物，将针头扔进尖锐的废物中。 肝脏解剖和固定通过将整个肝脏从周围组织和隔膜上切开来解剖。 轻轻地将整个肝脏置于空的50 mL锥形管中，腹侧朝上，背侧放在锥形管壁上，以防止肝脏变形。将锥形管水平存放在4°C下过夜，以使树脂完全硬化。注意：任何足够大以适合肝脏的容器都可以代替50 mL锥形管。使用平底容器会增加肝脏不变形的可能性。 将肝脏分成单独的叶。选择将用于microCT分析（1.4.4-1.4.5）或质量控制（1.4.6-1.4.8）的波瓣。可选择使用整个肝脏进行光学清除和microCT，而不将其分成单独的肺叶。注意：每个叶的胆道和血管系统的肝脏结构不同，因此需要匹配的叶分析。光学清除不会干扰microCT扫描，并且用于质量控制的凸轮随后可以使用microCT进行扫描。相反，用microCT扫描的样品随后可以光学清除进行比较。因此，全肝分析是可能的。在野生型小鼠（C3H / C57bl6遗传背景）中，首先通过树脂注射填充正确的内侧叶，使其成为适合microCT分析的叶，具有最高的可重复性。左侧叶是最大的叶，因此可以直接预先筛选注射质量。用于质量控制和microCT扫描的叶（或整个肝脏）的选择取决于动物模型和研究问题。 在通风罩中，准备4%甲醛溶液（每管10-20毫升）。用4%甲醛在4°C下固定用于microCT的叶片过夜，然后用PBS洗涤一次（每管10-20mL）。 将甲醛废物收集在单独的容器中。将肝叶保持在PBS中，在4°C下进行短期储存，或将70%乙醇长期储存。继续执行第2节：微型计算机断层扫描。注意：甲醛如果吞咽、吸入或与皮肤接触，会引起急性毒性。甲醛是一种易燃液体和蒸气。它会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。可能引起皮肤过敏反应。吸入（浓缩或粉末）致命。可能引起呼吸道刺激。怀疑引起遗传缺陷。可能导致癌症。对器官（眼睛，中枢神经系统）造成损害。预防措施 – 远离热源、热表面、火花、明火和其他点火源。禁止吸烟。戴上防护手套和防护服。如果发生溢出，请立即脱下所有被污染的衣服。如果与皮肤接触：用水冲洗污染区域。如果吸入：将人转移到新鲜空气中，并在呼吸舒适时监测呼吸。立即致电中毒中心/医生。如果进入眼睛：用水冲洗眼睛几分钟。如果存在且可能，请取下隐形眼镜。 为了进行质量控制，用50%甲醇（与去离子水混合）固定剩余的裂片（至少一个）至少4小时，在室温下摇摆，然后在室温下100%甲醇摇动过夜。将甲醇废物收集在单独的容器中。注意：甲醇如果吞咽、吸入或与皮肤接触，会引起急性毒性。甲醇是一种易燃液体和蒸气。戴上防护手套和衣服。处理时避免呼吸，远离火源和热源。使用后彻底清洗皮肤。如果发生溢出，请立即脱下所有受污染的衣服。用水冲洗皮肤。吸入时：将人转移到新鲜空气中，保持呼吸舒适。如果吸入、吞咽或暴露，请致电中毒中心/医生。 在通风罩中，制备苯甲醇和苯甲酸苄酯（BA：BB，1：2）（每叶5-10mL）溶液。 将肝叶置于含有BABB溶液的15或50mL聚丙烯管（取决于叶的大小）中。让它在室温下摇摆，直到透明。该步骤可能需要2-16小时，具体取决于波瓣的大小。注意：BABB溶液可溶解某些类型的塑料。将样品储存在聚丙烯管或玻璃容器中是安全的。注意：苯甲酸苄酯吞咽时会引起急性毒性。它对水生生物有毒，具有长期影响。注意事项：处理后彻底清洗皮肤。吞咽、接触皮肤或吸入时有害。避免吸入烟雾/蒸气。处理后彻底洗手。使用本产品时，请勿进食、饮水或吸烟。如果吞咽 – 如果身体不适，请呼叫中毒中心/医生 在通风处使用。收集溢出物。将内容物/容器处置到经批准的废物处理厂。 检查注射的质量。只有注射良好的肝脏才应使用microCT进行扫描。 2. 微型计算机断层扫描 样品制备 通过混合100mL蒸馏水和1g琼脂糖粉来制备1%琼脂糖凝胶。将混合物置于微波炉中，煮沸溶液，直到琼脂糖粉末溶解。 将1%琼脂糖凝胶回火至~40°C，以避免对肝脏样品的热损伤。 将感兴趣的叶置于15 mL锥形管中，并用1%琼脂糖凝胶填充至管总体积的约2/3。此步骤可最大限度地减少 CT 测量过程中不需要的样品运动。 断续器测量注意：以下步骤取决于 CT 设备，并且针对不同的 CT 设备和制造商，特定设置和操作可能有所不同。在该协议中，使用的微型计算机断层扫描器配备了纳米焦点X射线管（180 kV / 15 W）和平板动态41|100（4048 px x 4048 px，像素尺寸为100 mm，合并2）用于CT测量。 将15 mL锥形管与样品一起安装在CT设备的旋转台上，并使其热适应测量室至少1小时。 当样品经过热适应时，将其置于视场（FOV）的中心。 优化源样本和样本检测器距离（SSD、SDD）以达到足够的体素分辨率，例如，成人鼠肝样本为12 μm，<P30肝脏为6.5 μm，对应于FOV的尺寸（对于事先指定的硬件）24.3 mm×24.3 mm和13.2 mm×13.2 mm。 按照 CT 设备制造商的建议设置采集参数（即，加速电压和电流、曝光、分档、平均），以达到足够的检测到信号水平。这些参数不仅与CT设备相关，而且与样品相关，应针对每个样品进行优化。在Hankeova等人9中，设置为：80 kV加速电压，160μA加速电流，400 ms曝光时间和2000张图像。 开始 CT 测量。使用专用的断层扫描重建软件重建CT数据。 3. 分析和数据分割 注：以下步骤取决于图像处理软件。具体设置和操作可能因所使用的软件而异。 加载 CT 数据：选择” 文件”>”导入>命令”。进一步的选择取决于要处理的CT数据的特定格式。 使用顶部面板上的 “表面测定” 功能，使用全局阈值对数据中的树脂进行分段。在对话框窗口中，通过将红色”等值”线的位置设置为仅分割树脂填充的容器（即，由显示的”预览面板”中的黄线包含）来确定具有直方图评估的阈值（图3A）。 在左侧面板上，选择模块 “从体积/CAD/网格创建 ROI” ，以创建树脂填充容器的感兴趣区域 （ROI）。在对话框窗口中，使用选项 “从实体创建 ROI”，选择已处理卷的名称并确认。 消除此 ROI 背景区域中噪声簇的错误分段。在右侧面板上标记此 ROI，右键单击它并选择模块 “拆分 ROI”。 在对话窗口中，设置 最小体积[体素] 参数以排除所有噪声颗粒 – 该值取决于实验和数据，必须针对要分析的每个样品进行优化（图3B）。 创建平滑、连续和坚固的运河掩模，树脂铸造 ROI 中不会出现伪影 – 例如，存在气泡或树脂泄漏。 在左侧面板上，使用模块 平滑，将 平滑强度 参数设置为 1 或 2（取决于单个数据，当较高的值可能导致模型变形时，尤其是在处理精细结构时）。如果需要，请运行此过程两次（图3C）。 识别并分离分段树脂掩模中的各个管状系统。 为填充吸收性更强的树脂（用于胆总管注射的黄色树脂）的系统创建单独的ROI，CT数据中的强度值更高。按照步骤 3.2 中描述的过程进行操作。（图3Di）。 标记新的 ROI 和树脂掩模 ROI，右键单击并选择减 去 ROI（S） 并从树脂掩模 ROI 中减去新的 ROI，为剩余的管状系统创建新的 ROI（图 3Dii， iii）。 根据操作员的偏好，以各种格式导出两个管状系统的收益，以便在不同的软件中进行后续处理。此外，在体积图形软件中处理由此产生的ROI，以图像或视频的形式导出最终的可视化。