引发分枝杆菌葡萄膜炎（PMU）作为感染后葡萄膜炎的模型

所有执行的程序均由华盛顿大学动物护理和使用委员会（动物研究协议#4481-02）在当地批准，或符合英国内政部许可证（PPL 30/3281）和布里斯托大学伦理审查小组。在这两个机构进行的实验符合视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。PMU在6-10周龄的C57BL / 6J小鼠中产生;所有小鼠在葡萄膜炎诱导时体重至少为18g，并且被确认为Crb1基因29的R8突变阴性。 在特定的 无病原体条件下，用标准食物和药水（对乙酰氨基酚200-300mg / kg /天）随意维持小鼠。动物安乐死使用标准的二氧化碳吸入方法30进行。 1.皮下注射抗原制剂 在化学通风橱内执行本节中的所有程序，以防止吸入或皮肤接触 Mtb H37Ra 粉末。根据您的机构政策处理完全弗氏佐剂（通常为 BSL-1）。这包括使用耐化学腐蚀的手套、安全眼镜和防护工作服（实验室外套）。 使用良好的无菌技术来防止将引入实验动物的试剂污染。 通过在 5 mL 微量离心管中混合 5 mg 冻干、热杀灭结 核分枝杆菌 H37Ra 粉末与 2.5 mL 冷 PBS，在 PBS 中制备 Mtb 悬浮液。涡旋一次30秒，然后放在冰上。 为了在PBS中产生H37Ra的精细悬浮液，请将悬浮液在冰上超声处理5分钟。松开转换器单元的主体，用 70% （v/v） 酒精棉签清洁探头。 打开超声仪，通过转动功率控制旋钮将功率设置调整为 4，然后将探头的尖端浸入含有 PBS 的分枝杆菌粉末中。确保探针尖端浸入样品深度的至少一半，并且探针尖端不接触微量离心管的壁。 将混合物在冰上超声处理30秒，暂停30秒，重复总共5分钟，以使粉末完全分散到均匀的悬浮液中，而无需加热液体。 向混合物中加入 2.5 mL 弗氏不完全佐剂，并在冰上重复超声处理过程，直到乳液形成牙膏状稠度。 使用控制旋钮将功率设置为 0，然后关闭设备以结束超声处理。从悬浮液中取出尖端，然后用酒精棉签擦拭探头。 将抗原乳剂储存在4°C。 分批制作乳液将有助于确保实验之间的一致性。乳液可在4°C下储存长达3个月。 2.皮下注射 在玻璃体内注射前一周进行皮下注射（指定为-7天）。 用分枝杆菌乳剂装入 1 mL 注射器（未连接针头）。由于乳液的粘度和不透明度，难以看到的气泡会充满注射器。为防止注射器中出现气泡，在装入0.2-0.3毫升乳液后，倒置注射器（尖端朝上），并在计数器边缘反复轻轻敲击注射器，使气泡浮出水面。 从注射器中排出空气并继续填充注射器。倒置并间歇性点击直至填满。 将25 G针头放在注射器上，并推进乳液以填充针头。将注射器存放在冰上直至使用。 为了安全地进行皮下注射，要么麻醉小鼠，要么利用人道的约束方法，以便于接近动物后躯31。 为了麻醉皮下注射，将动物置于异氟醚诱导室中（诱导3%-4%，维持1%-3%）。麻醉后，确保小鼠呼吸频率缓慢且没有呼吸窘迫的迹象。 将皮下注射放在臀部的背表面，或腹股沟淋巴结区域近端的腿腹面。小心地插入针头以防止注射到肌肉中。将 0.05 mL 的 Mtb 乳剂注入皮下腔。不要立即取出针头，以使浓稠的乳液完全注入。 在左侧和右侧重复注射，每只动物总共0.1mL。 如果麻醉，将鼠标放在温暖的加热垫上，直到完全恢复。在小鼠恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。 完全恢复后将小鼠放回笼子，并在笼卡上标记皮下注射日期。 口服对乙酰氨基酚（200 mg/kg/天）提供镇痛，但不能使用非甾体抗炎药，因为抗炎药会影响葡萄膜炎的诱导。 3.玻璃体内注射用抗原原液制备 在适当的无菌条件下执行本节中的所有程序，以防止玻璃体内Mtb悬浮液的污染。 进行玻璃体内悬浮液。对于轻度至中度全葡萄膜炎的诱导，通过将 5 mg 分枝杆菌提取物加入 1 mL 的 1x PBS 中，使玻璃体内悬浮液浓度为 5 mg/mL。 对于中度至重度全葡萄膜炎的诱导，通过将 10 mg 分枝杆菌提取物添加到 1 mL 的 1x PBS 中，使玻璃体内悬浮液浓度为 10 mg/mL。 涡旋一次30秒，然后放在冰上。 为了在PBS中产生H37Ra的精细悬浮液，如步骤1.4中所述，将悬浮液在冰上超声处理10分钟。将该储备溶液分装在100μL体积中，并储存在-20°C。 使用前，在室温下解冻并在高温下涡旋1分钟。将等分试样放在冰上，同时运送到动物设施。 4. 第0天玻璃体内注射程序 动物制备戴上合身的检查手套，将鼠标放在称量天平上，以获得其重量（克）。 腹膜内注射0.02mL/g体重含有100mg/mL氯胺酮和20mg/mL甲苯噻嗪的溶液，与无菌水混合，以麻醉动物。另一种方法是使用~1.5%异氟醚（吸入）进行诱导。 等待大约2分钟让鼠标入睡，然后将鼠标放入加热盒中并盖上盖子。进行疼痛反射测试，如耳朵、脚趾和尾巴捏，以评估手术的麻醉深度32. 入睡后，用1滴0.5%（v / v）丁卡因麻醉角膜。避免在小鼠的鼻子或嘴巴附近沾染丁卡因。10秒后，擦去多余的液体。注意：据观察，局部麻醉时虹膜扩张和前房（AC）可视化得到改善，这可能是由于全身麻醉和局部麻醉联合改善了角膜反射抑制。但是，如果需要，可以省略此步骤。 用 1 滴 2.5% （v/v） 去氧肾上腺素扩张瞳孔。小心避免任何可能进入鼻子或嘴巴的多余飞沫。2-3分钟后，擦去多余的液体。 为了降低眼内炎的风险，在眼睛表面和周围的头发上添加1滴5%的甜菜碱。留在眼睛上2-3分钟。注意：在适当的无菌条件下执行本节中的所有程序，以防止眼内炎。 去除甜菜碱并用羟丙甲纤维素（0.3%）或卡波姆眼凝胶0.2%w / w）覆盖眼睛，以防止麻醉下干燥。这也将有助于预防白内障的形成。 设置显微注射系统使用连接到微量注射器泵控制器和注射注射器的微泵进行玻璃体内注射（图1A-C）。或者，如第4.4小节所述，用连接到汉密尔顿注射器的33G针头注射。 将 34 G 针头连接到注射支架以组装注射器。松开注射支架前端的银色螺帽，将针头滑入支架主体约一半。拧紧银色螺旋盖手指。 按照步骤4.2.4-4.2.5所述将管道连接到注射支架。 要将管子插入注射支架上，请松开支架后端的塑料螺钉，将管道滑过内部的垫圈并拧紧螺钉。 与管子末端保持轻微的间隙，以防止在注射过程中损坏管子。请参阅 图 1C。 解冻 100 μL 等分试样的分枝杆菌原液悬浮液。 加入 3 μL 1% 荧光素钠 （AK-Fluor） 溶液并涡旋良好。 用抗原和荧光素混合物加载 10 μL 注射器，不含任何气泡。 从注射器中取出装载针头，然后将管子滑过银色螺旋盖垫圈，直到尖端达到注射器主体中的零标记。 一旦管子的尖端正确对准所需位置，请拧紧螺旋盖手指。 通过注射管冲洗注射器中的溶液以完全加载系统。然后重复步骤4.2.8-4.2.11以重新装填注射器进行注射。 要将装载的注射器安装在微型泵上，请按下微型泵末端的夹子释放按钮以打开注射器夹。 将柱塞盖放入微泵后端的柱塞盖支架中。 然后将注射器套圈滑到环挡块上，并将注射器主体滑入注射器夹中。 松开夹紧按钮并拧紧柱塞固定螺钉。请参阅 图 1D。 将注射支架和针头滑过立体定向注射装置上的O形夹。这是一个自定义平台;或者，注射器可以手动握住和定位。 在微量注射泵控制器上设置输液量和输液量速率，分别以40nL / s的速率在每个周期注射500nL。注意：可以使用更快的注射速率，但是，在实现针头重新定位之前可能会经历更多的回流。 在进行玻璃体内注射之前测试系统以确保功能正常。注意：当注射系统正常运行时，使用脚踏板或控制垫激活注射循环将产生柱塞帽支架的可见运动，并且在针尖处会看到一小滴绿色液体。在没有产生液体的情况下，激活额外的循环或冲洗并重新加载注射器。 在注射眼睛之前，用95%乙醇垫轻轻擦拭针头。 玻璃体内注射程序将鼠标放置在立体定位装置上以执行注射程序。 通过在鼠标表面上贴上 2-3 张纸巾来保持鼠标休息的载物台/平台温暖。 将鼠标放在平台上的俯卧位置。使用左右耳杆轻轻固定动物的头部。请参阅 图 1E。 将鼠标定位并在瞄准镜下方定向，以便可以看到右眼的鼻上侧。 使用30克针移位睫毛并露出巩膜。可视化视角膜缘和桡骨血管。 使用无菌 30 G 针在巩膜边缘后方 1-2 mm 处开一个引导孔。 将连接到注射支架的34 G针头通过导孔以避开晶状体的角度插入眼睛，但将针尖放入玻璃体腔中。 使用微量注射器泵控制器，小心地将 1 μL Mtb 提取物注入玻璃体腔。在持续回流的情况下，将进样体积增加到1.5μL以确保足够的剂量输送。注意：对于假对照，将 1 μL PBS 注入动物的眼睛。 通过观察眼睛中的绿色反射来验证玻璃体内放置。请参阅 图 1F。 10秒后，从眼睛上拔出针头。注意任何反流。 从平台上取出鼠标，将0.3%羟丙甲纤维素或0.2%w/w卡波姆眼膏放在双眼上以保护角膜，然后移至恢复加热箱。 在小鼠恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。在完全康复之前，不要回到其他动物的陪伴下。 当小鼠完全清醒时，返回笼子并加入对乙酰氨基酚（200-300mg / kg /天）药水瓶。在笼卡上标记IVT注射的日期。 玻璃体内注射通常耐受性良好。可能提示疼痛和需要从研究中移除的临床体征包括眼周脱发（提示自我创伤）、角膜溃疡、体重减轻和驼背姿势。 玻璃体内注射的替代方法注意：此过程使用手术显微镜和微量注射器上的33 G针头进行。撑起眼睛并用一对镊子将其固定到位。 然后涂抹 0.2% w/w 或 0.3% 羟丙甲纤维素眼部凝胶，并将圆形盖玻片（直径 7 毫米）放在眼睛上。 将 33 G 皮下注射针头安装在 5 μL 汉密尔顿注射器上，并以 ~45° 注射角将其沿角膜缘圆周约 2 mm 插入。 将针斜面引导到玻璃体中，停在晶状体和视盘之间（从外科医生的相对角度来看，这是在视盘上方/覆盖 – 距离插入部位约 1.5 毫米），并缓慢注射 2 μL Mtb（PBS 中的 2.5 ug/μL）。 短暂地将针头固定到位（以减少注射液的反流量），然后将其取出。 注射后，通过释放镊子来重新放置地球。此时可以滴1%的w/w氯霉素软膏给眼睛，以提供额外的保护，防止注射后眼内炎。 注射后，如步骤4.3.11-4.3.13所述移至恢复加温箱。 5. OCT成像检测和量化葡萄膜炎 动物制备按照步骤4.1.2-4.1.4中所述麻醉鼠标 用1滴2.5%去氧肾上腺素扩张瞳孔。小心避免任何可能进入鼻子或嘴巴的多余飞沫。2-3分钟后，擦去多余的液体。 将0.3%羟丙甲纤维素或0.2%w / w卡波姆凝胶放在眼睛上，以防止麻醉时干燥。这也将有助于预防白内障的形成。 将鼠标包裹在一层手术纱布中以保持身体温暖，并将其放在动物盒上。将头部与咬杆对齐。 获取前房和后房的OCT图像。注意：如果获取前房和后房图像，请先获取后房（PC）图像，以防止白内障形成后的图像退化。通过频繁润滑和使用 0.3% 羟丙甲纤维素或 0.2% w/w 卡波姆眼凝胶可以预防白内障的形成。对于扩展成像（>10分钟），保持鼠标温暖（通过使用加热垫）也有帮助。打开OCT成像系统后，固定正确的成像镜头并根据需要调整参考臂位置。 打开成像软件，创建唯一的鼠标 ID，然后按照 OCT 制造商的协议开始成像。 使用快速扫描方案的 “自由运行 ”选项，将眼睛的视神经定位在后房图像中心或角膜顶点放在前房图像上。注意： 表1 包含两种市售小动物成像系统的成像协议参数。有关产品规格，请参阅材料表 。 对于后房成像，将 OCT 靠近眼睛表面。小心避免使晶状体表面与眼睛接触。 眼睛正确定位后，停止快速扫描并选择体积扫描协议，然后使用 瞄准 选项激活扫描。 对于后节图像，调整直到视神经在水平B扫描对齐图像中居中，并且视网膜与垂直对齐轴对齐 对于前节图像，调整位置以使水平B扫描对齐图像和垂直对齐B扫描对齐图像中的角膜顶点居中。两个图像中存在反射伪影将确认正确对齐。然后将水平图像移动到足以删除反射伪影的程度。请参阅 图 2。 单击 快照 以捕获卷扫描映像，然后单击 保存。 接下来，获取平均中心插管扫描。打开扫描协议，然后单击瞄准，然后单击快照。右键单击同一面板，然后单击平均。 对双眼双眼重复步骤5.2.1-5.2.9。 收集所有图像后，从暗盒中取出鼠标，并在恢复期间提供角膜保护，如步骤4.3.11-4.3.13所示。 6. OCT对炎症进行评分 在被掩盖在治疗条件下的分级师的帮助下对OCT图像进行评分。注：对于鼠标型号中的PMU，建议使用 表2 中提供的评分系统。 如果同时获得前房（AC）和后房（PC）图像，则合并这些分数以获得每只眼睛的最终分数。注意：前房炎症在后房炎症之前消退。 7. 通过尸检组织学对炎症进行评分 在实验结束时，通过眼球摘除收集个体眼睛，在4%甲醛中固定过夜，然后进行石蜡包埋，切片和H&E染色33。注意：建议沿瞳孔视神经轴线进行多个4-8μm切片。注意：每只眼睛的三个部分由蒙面分级师使用 表3中提供的评分系统进行评分，三个部分的平均分数报告为最终的组织学炎症评分。