Резонансные анализы переноса энергии Фёрстера с временным разрешением для измерения эндогенных фосфорилированных белков STAT в клетках человека

Сигнальный путь JAK/STAT играет ключевую роль в опосредовании клеточных реакций на различные цитокины, интерфероны, факторы роста и связанные с ними ^{молекулы1,2}. Связывание этих лигандов со специфическими рецепторами клеточной поверхности приводит к активации JAK, которые, в свою очередь, активируют белки STAT путем фосфорилирования специфических остатков тирозина. Фосфорилирование STAT приводит к их димеризации и транслокации в ядро, где они оказывают свое влияние на транскрипцию регулируемых генов-мишеней. Семейство STAT состоит из семи членов: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b и STAT6. Члены играют сложную и существенную роль в регуляции физиологических клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, ангиогенез и регуляцию иммунной системы. Аномальная активация сигнальных путей STAT связана со многими заболеваниями человека, особенно раком и иммунными ^{состояниями3,4}. Таким образом, способность оценивать фосфорилирование белка STAT в нативной клеточной сигнальной среде важна как для академических исследований, так и для исследований по открытию лекарств.

На сегодняшний день традиционные методы, используемые для измерения внутриклеточных уровней фосфорилированного белка, включая STATs, основаны на антителах и включают вестерн-блоттинг, ИФА и цитометрию фосфопотока. Эти гетерогенные методы являются трудоемкими, трудоемкими, трудоемкими, подверженными ошибкам, с низкой пропускной способностью и часто ненадежными (например, вопросы специфичности) в случае западного блоттинга5. Напротив, однородные анализы требуют меньшего количества экспериментальных этапов, используют меньшие объемы образцов и поддаются HTS. Существует пять коммерчески доступных платформ иммуноанализа на основе однородных клеток, которые можно использовать для количественного мониторинга JAK-зависимого фосфорилирования STATs в клеточных лизатах: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen и Lumit. Каждая из этих платформ имеет свои преимущества и недостатки.

SureFire основан на люминесцентной технологии канала кислорода, которая использует донорские и акцепторные шарики, покрытые специальным захватом пары антител, одно из которых является биотинилированным. В присутствии фосфорилированного белка два антитела приближают донорские и акцепторные шарики, что позволяет генерировать хемилюминесцентный ^{сигнал6}. Несмотря на универсальность и чувствительность, эта технология является дорогостоящей, подвержена влиянию биотина в питательной среде, очень чувствительна к температуре окружающей среды и свету и требует специального считывателя для обнаружения. HTRF и LANCE основаны на технологии TR-FRET, которая использует люминесцентные ионные комплексы лантаноидов с длительным сроком службы (хелаты европия или тербия, или криптат европия) в качестве донорских молекул и дальние красные флуорофоры в качестве молекул-акцепторов7. Когда два белково-специфических антитела, меченные донорскими или акцепторными молекулами, находятся в непосредственной близости, происходит FRET, вызывая увеличение акцепторной флуоресценции и снижение донорской флуоресценции. Эти долгоживущие флуоресцентные сигналы могут быть измерены с временным разрешением и ратиометрическим способом, чтобы уменьшить помехи анализа и повысить качество данных. Другие преимущества TR-FRET заключаются в том, что он не светочувствительн, позволяет повторять показания и демонстрирует длительную стабильность сигнала. В то время как TR-FRET широко применяется в HTS из-за его универсальности, чувствительности и высокой надежности, все коммерческие платформы анализа на основе TR-FRET являются дорогостоящими, что исключает его широкое внедрение в академических и небольших промышленных лабораториях. Анализ LanthaScreen также использует считывание на основе TR-FRET, но зависит от инженерной клеточной линии U2OS, которая стабильно экспрессирует зеленый флуоресцентный белок (GFP)-STAT1 в сочетании с меченым тербием фосфо-специфическим антителом ^STAT18. Помимо того, что этот метод ограничен с точки зрения выбора сигнальных белков, он требует покупки дорогостоящих трансфектированных клеточных линий, снижения его применимости и увеличения возможности экспериментальных артефактов. Lumit – это универсальная платформа для биолюминесцентного иммуноанализа, которая использует вторичные антитела (против мышей и кроликов), химически меченые малыми и большими субъединицами NanoBit Люциферазы ^NanoLuc9. Связывание двух первичных антител с целевым белком приводит вторичные антитела в близость, образуя активный фермент, который генерирует сигнал люминесценции. В то время как люминесценция, как правило, является чувствительным и надежным считыванием, потребность в первичных антителах, выращенных у двух разных видов, ограничивает выбор конструкции анализа. Кроме того, использование вторичных антител в сложных матрицах образцов может быть склонно к анализу интерференции.

Таким образом, по-прежнему существует потребность в надежной, быстрой, но доступной клеточной аналитической платформе для измерения отдельных фосфорилированных и общих белков STAT способом, совместимым с HTS. Для удовлетворения этой потребности была разработана новая высокопроизводительная клеточная иммунологическая платформа, основанная на усовершенствованной технологии TR-FRET (THUNDER) и предназначенная для обеспечения простого, чувствительного, надежного и экономически эффективного измерения эндогенно экспрессированных внутриклеточных белков (фосфорилированных или общих) в клеточных лизатах. Преимущества этой технологии связаны с комбинацией пары донор/акцептор FRET, демонстрирующей исключительную спектральную совместимость и сигнал TR-FRET, строго проверенные антитела и оптимизированные буферы лизиса. Эти анализы форматируются как сэндвич-иммуноанализы и используют простой трехэтапный рабочий процесс (рисунок 1). Клетки сначала обрабатывают для модуляции фосфорилирования белка, а затем лизируют специфическим буфером лизиса, предусмотренным в наборе. Целевой фосфорилированный или общий белок STAT в клеточном лизате обнаруживается на стадии добавления и инкубации реагента с парой флуорофор-меченых антител, которые распознают различные эпитопы на белке-мишени (рисунок 2). Одно антитело маркируется донором хелата европия (Eu-Ab1), в то время как второе антитело маркируется дальним красным акцепторным флуорофором (FR-Ab2). Два меченых антитела связываются с белком в растворе, в результате чего две метки находятся в непосредственной близости. Возбуждение донорского хелата европия при 320 или 340 нм запускает FRET к акцептору, который излучает долгоживущий сигнал TR-FRET на 665 нм, пропорциональный концентрации белка-мишени (фосфорилированного или общего) в клеточном лизате.

Рисунок 1: Рабочий процесс анализа TR-FRET. Рабочий процесс состоит из трех этапов: обработка клеток, лизис клеток и обнаружение белка с использованием TR-FRET. В протоколе двухпластинчатого анализа лизаты переносятся на белую 384-луночную детектирующую пластину, тогда как в протоколе с одной пластиной все этапы проводятся в одной и той же белой 384-луночной детектирующей пластине (протокол «все в одной скважине»). Независимо от используемого протокола анализа, обнаружение белка выполняется в одном и том же общем объеме (20 мкл на лунку). Аббревиатура: TR-FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера с временным разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Принцип иммунологического анализа сэндвича TR-FRET. Одно антитело маркируется донором хелата европия (Eu-Ab1), а второе — дальнокрасым малым флуорофорным акцептором (FR-Ab2). Два меченых антитела связываются специфически с различными эпитопами на белке-мишени (фосфорилированном или общем) в клеточном лизате, в результате чего два флуорофора находятся в непосредственной близости. Возбуждение донора хелата европия при 320 или 340 нм запускает FRET от донора к молекулам-акцепторам, которые в свою очередь излучают сигнал на 665 нм. Этот сигнал пропорционален концентрации белка в клеточном лизате. При отсутствии специфического белка-мишени донорский и акцепторный флуорофоры находятся слишком далеко друг от друга для возникновения FRET. Сокращения: FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; TR-FRET = фрет с временным разрешением; Ab = антитело; FR = дальний красный; Eu – хелат европия; P = фосфорилирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Здесь представлены подробные протоколы для измерения в формате 384 лунки внутриклеточных уровней фосфорилированных STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) и STAT6 (Y641) вместе с общим количеством STAT1, STAT3, STAT5 и STAT6 в лизатах клеток из адгезивных или суспензионных ячеек с использованием платформы THUNDER TR-FRET. Эти протоколы определяют этапы обработки клеток, лизиса и обнаружения целевого белка на основе TR-FRET с использованием либо протокола передачи двух пластин, либо протокола «все в одной скважине». Эти клеточные анализы применяются для определения фармакологического профиля известных активаторов и ингибиторов пути JAK/STAT. Продемонстрирована надежность и пригодность выбранных анализов для ХТШ. Наконец, обсуждаются ключевые эксперименты по оптимизации анализа, а также рекомендации по устранению неполадок анализа.