Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas

A via de sinalização JAK/STAT desempenha um papel fundamental na mediação de respostas celulares a diversas citocinas, interferons, fatores de crescimento e moléculas ^{relacionadas1,2}. A ligação desses ligantes a receptores específicos de superfície celular resulta na ativação de JAKs, que por sua vez ativam proteínas STAT por fosforilação de resíduos específicos de tyrosina. A fosforilação STAT resulta em sua dimerização e translocação para o núcleo, onde exercem seu efeito sobre a transcrição de genes-alvo regulados. A família STAT é composta por sete membros: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b e STAT6. Os membros desempenham um papel complexo e essencial na regulação dos processos fisiológicos das células, incluindo proliferação, diferenciação, apoptose, angiogênese e regulação do sistema imunológico. A ativação anormal das vias de sinalização STAT está implicada em muitas doenças humanas, especialmente câncer e condições ^{imunológicas3,4}. Portanto, a capacidade de avaliar a fosforilação da proteína STAT dentro do ambiente de sinalização celular nativa é importante tanto para pesquisas acadêmicas quanto de descoberta de drogas.

Até o momento, os métodos convencionais utilizados para medir os níveis de proteína fosfoilada intracelular, incluindo OST, são à base de anticorpos e incluem mancha ocidental, ELISA e citometria fosfoflua. Esses métodos heterogêneos são intensivos em mão-de-obra, demorados, propensos a erros, baixo rendimento e, muitas vezes, não confiáveis (por exemplo, questões de especificidade) no caso de manchas ocidentais5. Em contraste, ensaios homogêneos requerem menos etapas experimentais, usam volumes amostrais menores e são favoráveis ao HTS. Existem cinco plataformas homogêneas de imunoensaio baseadas em células disponíveis comercialmente que podem ser usadas para monitorar quantitativamente a fosforilação dependente de STATs em lises celulares: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen e Lumit. Cada uma dessas plataformas tem suas vantagens e desvantagens.

SureFire é baseado na tecnologia luminescente de canalização de oxigênio, que utiliza contas de doadores e aceitadores revestidas para capturar especificamente um par de anticorpos, um dos quais é biotinilado. Na presença de proteína fosfoilada, os dois anticorpos aproximam o doador e o aceitador, permitindo a geração de um sinal ^{quimiomanuminescente6}. Embora versátil e sensível, essa tecnologia é cara, é afetada pela biotina no meio da cultura, é muito sensível à temperatura ambiente e à luz, e requer um leitor especial para detecção. HTRF e LANCE são ambos baseados na tecnologia TR-FRET que utiliza complexos de íons de ion de lantano luminescente de longa duração (europium ou terbium chelates, ou criptoato europium) como as moléculas doadoras e fluoroforos distantes como as moléculas ^aceitadoras7. Quando dois anticorpos específicos de proteína rotulados com moléculas doadoras ou aceitadoras são trazidos para a proximidade, o FRET ocorre, causando um aumento da fluorescência aceitadora e uma diminuição da fluorescência do doador. Esses sinais fluorescentes de longa duração podem ser medidos de forma econômica e racionável para reduzir a interferência de ensaios e aumentar a qualidade dos dados. Outras vantagens do TR-FRET são que ele não é sensível à luz, permite leituras repetidas e exibe estabilidade de sinal longa. Embora o TR-FRET seja amplamente implementado no HTS devido à sua versatilidade, sensibilidade e alta robustez, todas as plataformas comerciais de ensaio baseadas em TR-FRET são caras, impedindo assim sua ampla adoção em laboratórios acadêmicos e pequenos industriais. O ensaio LanthaScreen também usa uma leitura baseada em TR-FRET, mas depende de uma linha celular U2OS projetada que expressa a proteína fluorescente verde (GFP)-STAT1 proteína de fusão combinada com um anticorpo STAT1 phospho-specific phospho-specific^. Além de limitado em termos de escolha de proteínas de sinalização, este método requer a compra de linhas celulares transfectadas caras, reduzindo sua aplicabilidade e aumentando a possibilidade de artefatos experimentais. Lumit é uma plataforma genérica de imunoensaio bioluminescente que utiliza anticorpos secundários (anti-rato e anti-coelho) quimicamente rotulados com as pequenas e grandes subunidades NanoBit da NanoLuc Luciferase9. A ligação de dois anticorpos primários à proteína alvo traz os anticorpos secundários à proximidade para formar uma enzima ativa que gera um sinal de luminescência. Embora a luminescência seja geralmente uma leitura sensível e robusta, a exigência de anticorpos primários criados em duas espécies diferentes limita as escolhas para o design do ensaio. Além disso, o uso de anticorpos secundários em matrizes amostrais complexas pode ser propenso a talda interferência.

Assim, ainda existe uma necessidade de uma plataforma de ensaio confiável, rápida, mas acessível baseada em células para medir proteínas STAT fosforiladas individuais e totais de uma maneira compatível com HTS. Para atender a essa necessidade, uma nova plataforma de imunoensaio baseada em células de alto rendimento foi desenvolvida com base em uma tecnologia TR-FRET aprimorada (THUNDER) e projetada para permitir uma medição simples, sensível, robusta e econômica de proteínas intracelulares expressas endógenamente (fosfoiladas ou totais) em lises celulares. As vantagens dessa tecnologia decorrem da combinação de um par FRET doador/aceitor exibindo compatibilidade espectral excepcional e sinal TR-FRET, anticorpos rigorosamente validados e buffers de lise otimizados. Estes ensaios são formatados como imunoensaio sanduiche e usam um fluxo de trabalho simples de três etapas (Figura 1). As células são primeiro tratadas para modular a fosforilação proteica e, em seguida, lysed com o tampão de lise específico fornecido no kit. A proteína STAT fosforilada ou total no liseto celular é detectada em um único passo de adição e incubação de reagentes com um par de anticorpos rotulados por fluoforo que reconhecem epítopos distintos na proteína alvo (Figura 2). Um anticorpo é rotulado com um doador de quelato europium (Eu-Ab1), enquanto o segundo anticorpo é rotulado com um fluoróforo aceitador vermelho distante (FR-Ab2). Os dois anticorpos rotulados se ligam à proteína em solução, aproximando os dois rótulos. A excitação do doador Europium chelate a 320 ou 340 nm desencadeia um FRET para o aceitador, que emite um sinal TR-FRET de longa duração a 665 nm proporcional à concentração de proteína-alvo (fosfoilada ou total) no lysato celular.

Figura 1: Fluxo de trabalho de ensaio TR-FRET. O fluxo de trabalho consiste em três etapas: tratamento celular, lise celular e detecção de proteínas utilizando TR-FRET. No protocolo de ensaio de duas placas, os lysates são transferidos para uma placa de detecção branca de 384 poços, enquanto no protocolo de uma placa, todas as etapas são conduzidas na mesma placa branca de detecção de 384 poços (protocolo tudo em um poço). Independentemente do protocolo de ensaio utilizado, a detecção de proteínas é realizada no mesmo volume total (20 μL por poço). Abreviação: TR-FRET = transferência de energia de ressonância Förster resolvida pelo tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Princípio de imunoensaio do sanduíche TR-FRET. Um anticorpo é rotulado com o doador de quelato europium (Eu-Ab1) e o segundo com o pequeno aceitador de fluoreóforo (FR-Ab2). Os dois anticorpos rotulados se ligam especificamente a epítopos distintos na proteína alvo (fosforilado ou total) no lysato celular, aproximando os dois fluoroforos. A excitação do doador Europium chelate a 320 ou 340 nm desencadeia um FRET do doador para as moléculas aceitadoras, que por sua vez emitem um sinal a 665 nm. Este sinal é proporcional à concentração de proteína no lisecelular. Na ausência da proteína alvo específica, os fluoroforos doadores e aceitantes estão muito distantes um do outro para que o FRET ocorra. Abreviaturas: FRET = Transferência de energia de ressonância förster; TR-FRET = FRET resolvido pelo tempo; Ab = anticorpo; FR = vermelho distante; Eu – Europium chelate; P = fosforilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para medir, em formato 384-well, os níveis intracelulares de STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641), juntamente com STAT1 total, STAT3, STAT5 e STAT6, em células de células aderentes ou suspensas usando a plataforma THUNDER TR-FRET. Esses protocolos definem etapas para tratamento celular, lise e detecção de proteína de alvo baseada em TR-FRET usando um protocolo de transferência de duas placas ou um protocolo all-in-one-well. Esses ensaios baseados em células são aplicados para determinar o perfil farmacológico de ativadores e inibidores conhecidos da via JAK/STAT. A robustez e adequação dos ensaios selecionados para HTS são demonstradas. Por fim, são discutidos experimentos-chave para otimização de ensaios, juntamente com recomendações para a solução de problemas de ensaio.