Saggi di trasferimento di energia di Förster Resonance risolti nel tempo per la misurazione di proteine STAT fosforilate endogene in cellule umane

La via di segnalazione JAK/STAT svolge un ruolo chiave nel mediare le risposte cellulari a diverse citochine, interferoni, fattori di crescita e molecole ^correlate1,2. Il legame di questi ligandi a specifici recettori della superficie cellulare provoca l’attivazione di JAK, che a loro volta attivano le proteine STAT mediante fosforilazione di specifici residui di tirosina. La fosforilazione STAT provoca la loro dimerizzazione e traslocazione nel nucleo, dove esercitano il loro effetto sulla trascrizione dei geni bersaglio regolati. La famiglia STAT è composta da sette membri: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b e STAT6. I membri svolgono un ruolo complesso ed essenziale nella regolazione dei processi cellulari fisiologici, tra cui proliferazione, differenziazione, apoptosi, angiogenesi e regolazione del sistema immunitario. L’attivazione anomala delle vie di segnalazione STAT è implicata in molte malattie umane, in particolare il cancro e le condizioni immuno-correlate3,4. Pertanto, la capacità di valutare la fosforilazione della proteina STAT all’interno dell’ambiente di segnalazione cellulare nativo è importante sia per la ricerca accademica che per la scoperta di farmaci.

Ad oggi, i metodi convenzionali utilizzati per misurare i livelli di proteine fosforilate intracellulari, compresi gli ST, sono basati su anticorpi e includono western blotting, ELISA e citometria a fosfoflusso. Questi metodi eterogenei sono laboriosi, dispendiosi in termini di tempo, soggetti a errori, a bassa produttività e spesso inaffidabili (ad esempio, problemi di specificità) nel caso del western blotting5. Al contrario, i saggi omogenei richiedono meno passaggi sperimentali, utilizzano volumi di campione più piccoli e sono suscettibili di HTS. Esistono cinque piattaforme di immunodosaggio omogenee basate su cellule disponibili in commercio che possono essere utilizzate per monitorare quantitativamente la fosforilazione JAK-dipendente degli ST nei lisati cellulari: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen e Lumit. Ognuna di queste piattaforme ha i suoi vantaggi e svantaggi.

SureFire si basa sulla tecnologia di canalizzazione dell’ossigeno luminescente, che utilizza perline di donatore e accettore rivestite per catturare specificamente un paio di anticorpi, uno dei quali è biotinilato. In presenza di proteine fosforilate, i due anticorpi portano le perle del donatore e dell’accettore nelle immediate vicinanze, consentendo la generazione di un segnale chemiluminescente6. Sebbene versatile e sensibile, questa tecnologia è costosa, è influenzata dalla biotina nel terreno di coltura, è molto sensibile alla temperatura ambiente e alla luce e richiede un lettore speciale per il rilevamento. HTRF e LANCE sono entrambi basati sulla tecnologia TR-FRET che utilizza complessi ioni di lantanidi luminescenti di lunga durata (chelati di europio o terbio o criptato di europio) come molecole donatrici e fluorofori rosso lontano come molecole ^accettori7. Quando due anticorpi protein-specifici etichettati con molecole donatori o accettori vengono portati nelle immediate vicinanze, si verifica FRET, causando un aumento della fluorescenza dell’accettore e una diminuzione della fluorescenza del donatore. Questi segnali fluorescenti di lunga durata possono essere misurati in modo tempo e raziometrico per ridurre le interferenze del test e aumentare la qualità dei dati. Altri vantaggi di TR-FRET sono che non è sensibile alla luce, consente letture ripetute e presenta una lunga stabilità del segnale. Mentre TR-FRET è ampiamente implementato in HTS grazie alla sua versatilità, sensibilità e elevata robustezza, tutte le piattaforme di analisi commerciali basate su TR-FRET sono costose, precludendo così la sua ampia adozione in laboratori accademici e piccoli laboratori industriali. Il test LanthaScreen utilizza anche una lettura basata su TR-FRET, ma si basa su una linea cellulare U2OS ingegnerizzata che esprime stabilmente la proteina fluorescente verde (GFP)-STAT1 combinata con un anticorpo STAT1 fosfo-specifico marcato con ^terbio8. Oltre ad essere limitato in termini di scelta delle proteine di segnalazione, questo metodo richiede l’acquisto di costose linee cellulari trasfettate, riducendone l’applicabilità e aumentando la possibilità di artefatti sperimentali. Lumit è una piattaforma di immunodosaggio bioluminescente generico che utilizza anticorpi secondari (anti-topo e anti-coniglio) chimicamente etichettati con le piccole e grandi subunità NanoBit di NanoLuc Luciferase9. Il legame di due anticorpi primari alla proteina bersaglio porta gli anticorpi secondari in prossimità per formare un enzima attivo che genera un segnale di luminescenza. Mentre la luminescenza è generalmente una lettura sensibile e robusta, il requisito di anticorpi primari allevati in due specie diverse limita le scelte per la progettazione del saggio. Inoltre, l’uso di anticorpi secondari in matrici di campioni complessi può essere soggetto a interferenze di analisi.

Pertanto, esiste ancora la necessità di una piattaforma di analisi basata su cellule affidabile, rapida ma conveniente per misurare le singole proteine STAT fosforilate e totali in modo compatibile con HTS. Per rispondere a questa esigenza, è stata sviluppata una nuova piattaforma di analisi immunologica basata su cellule ad alto rendimento basata su una tecnologia TR-FRET avanzata (THUNDER) e progettata per consentire una misurazione semplice, sensibile, robusta ed economica delle proteine intracellulari espresse endogenamente (fosforilate o totali) nei lisati cellulari. I vantaggi di questa tecnologia derivano dalla combinazione di una coppia FRET donatore/accettore che presenta un’eccezionale compatibilità spettrale e un segnale TR-FRET, anticorpi rigorosamente convalidati e tamponi di lisi ottimizzati. Questi test sono formattati come test immunologici sandwich e utilizzano un flusso di lavoro semplice in tre fasi (Figura 1). Le cellule vengono prima trattate per modulare la fosforilazione proteica e poi lisate con lo specifico tampone di lisi fornito nel kit. La proteina STAT fosforilata target o totale nel lisato cellulare viene rilevata in una singola fase di aggiunta e incubazione del reagente con una coppia di anticorpi marcati con fluoroforo che riconoscono epitopi distinti sulla proteina bersaglio (Figura 2). Un anticorpo è etichettato con un donatore di chelato di europio (Eu-Ab1), mentre il secondo anticorpo è etichettato con un fluoroforo accettore rosso lontano (FR-Ab2). I due anticorpi marcati si legano alla proteina in soluzione, portando le due etichette nelle immediate vicinanze. L’eccitazione del donatore chelato di europio a 320 o 340 nm innesca un FRET all’accettore, che emette un segnale TR-FRET di lunga durata a 665 nm proporzionale alla concentrazione di proteina bersaglio (fosforilata o totale) nel lisato cellulare.

Figura 1: Flusso di lavoro del saggio TR-FRET. Il flusso di lavoro consiste in tre fasi: trattamento cellulare, lisi cellulare e rilevamento delle proteine utilizzando TR-FRET. Nel protocollo di analisi a due piastre, i lisati vengono trasferiti su una piastra di rilevamento bianca a 384 pozzetti, mentre nel protocollo a una piastra, tutti i passaggi sono condotti nella stessa piastra di rilevamento bianca a 384 pozzetti (protocollo all-in-one-well). Indipendentemente dal protocollo di analisi utilizzato, il rilevamento delle proteine viene eseguito nello stesso volume totale (20 μL per pozzetto). Abbreviazione: TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Principio del test immunologico sandwich TR-FRET. Un anticorpo è etichettato con il donatore di chelato di europio (Eu-Ab1) e il secondo con l’accettore di fluoroforo piccolo rosso lontano (FR-Ab2). I due anticorpi marcati si legano specificamente a epitopi distinti sulla proteina bersaglio (fosforilata o totale) nel lisato cellulare, portando i due fluorofori nelle immediate vicinanze. L’eccitazione del donatore chelato di europio a 320 o 340 nm innesca un FRET dal donatore alle molecole accettori, che a loro volta emettono un segnale a 665 nm. Questo segnale è proporzionale alla concentrazione di proteine nel lisato cellulare. In assenza della proteina bersaglio specifica, i fluorofori donatore e accettore sono troppo distanti l’uno dall’altro perché si verifichi FRET. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; TR-FRET = FRET risolto nel tempo; Ab = anticorpo; FR = rosso lontano; Eu – Chelato di europio; P = fosforilazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Qui vengono forniti protocolli dettagliati per misurare, in un formato a 384 pozzetti, i livelli intracellulari di STAT1 fosforilato (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641), insieme a STAT1, STAT3, STAT5 e STAT6 totali, in lisati cellulari da cellule aderenti o in sospensione utilizzando la piattaforma THUNDER TR-FRET. Questi protocolli definiscono i passaggi per il trattamento cellulare, la lisi e il rilevamento di proteine bersaglio basate su TR-FRET utilizzando un protocollo di trasferimento a due piastre o un protocollo all-in-one-well a una piastra. Questi saggi basati su cellule sono applicati per determinare il profilo farmacologico di attivatori e inibitori noti della via JAK/STAT. La robustezza e l’idoneità dei saggi selezionati per HTS sono dimostrate. Infine, vengono discussi esperimenti chiave per l’ottimizzazione del test, insieme a raccomandazioni per la risoluzione dei problemi del test.