Tests de transfert d’énergie par résonance de Förster à résolution temporelle pour la mesure des protéines STAT phosphorylées endogènes dans les cellules humaines

La voie de signalisation JAK/STAT joue un rôle clé dans la médiation des réponses cellulaires à diverses cytokines, interférons, facteurs de croissance et molécules ^{apparentées1,2}. La liaison de ces ligands à des récepteurs spécifiques de la surface cellulaire entraîne l’activation des JAG, qui à leur tour activent les protéines STAT par phosphorylation de résidus de tyrosine spécifiques. La phosphorylation STAT entraîne leur dimérisation et leur translocation dans le noyau, où ils exercent leur effet sur la transcription des gènes cibles régulés. La famille STAT se compose de sept membres : STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b et STAT6. Les membres jouent un rôle complexe et essentiel dans la régulation des processus cellulaires physiologiques, y compris la prolifération, la différenciation, l’apoptose, l’angiogenèse et la régulation du système immunitaire. L’activation anormale des voies de signalisation STAT est impliquée dans de nombreuses maladies humaines, en particulier le cancer et les affections liées au système ^{immunitaire3,4}. Par conséquent, la capacité d’évaluer la phosphorylation des protéines STAT dans l’environnement de signalisation des cellules natives est importante pour la recherche universitaire et la découverte de médicaments.

À ce jour, les méthodes conventionnelles utilisées pour mesurer les niveaux de protéines phosphorylées intracellulaires, y compris les STAT, sont à base d’anticorps et comprennent le western blotting, l’ELISA et la cytométrie phosphoflow. Ces méthodes hétérogènes sont exigeantes en main-d’œuvre, chronophages, sujettes aux erreurs, à faible débit et souvent peu fiables (par exemple, des problèmes de spécificité) dans le cas du transfert ^Western5. En revanche, les essais homogènes nécessitent moins d’étapes expérimentales, utilisent des volumes d’échantillons plus petits et se prêtent à HTS. Il existe cinq plates-formes d’immunodosage cellulaires homogènes disponibles dans le commerce qui peuvent être utilisées pour surveiller quantitativement la phosphorylation dépendante de JAK des STAT dans les lysats cellulaires : SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen et Lumit. Chacune de ces plateformes a ses avantages et ses inconvénients.

SureFire est basé sur la technologie de canalisation de l’oxygène luminescent, qui utilise des billes de donneur et d’accepteur enduites pour capturer spécifiquement une paire d’anticorps, dont l’un est biotinylé. En présence de protéines phosphorylées, les deux anticorps rapprochent les perles donneuses et acceptatrices, permettant la génération d’un signal chimiluminescent6. Bien que polyvalente et sensible, cette technologie est coûteuse, est affectée par la biotine dans le milieu de culture, est très sensible à la température ambiante et à la lumière, et nécessite un lecteur spécial pour la détection. HTRF et LANCE sont tous deux basés sur la technologie TR-FRET qui utilise des complexes d’ions lanthanides luminescents à longue durée de vie (chélates d’europium ou de terbium, ou cryptate d’europium) comme molécules donneuses et des fluorophores rouge lointain comme molécules ^acceptrices7. Lorsque deux anticorps spécifiques à une protéine marqués avec des molécules donneuses ou acceptrices sont rapprochés, fret a lieu, provoquant une augmentation de la fluorescence de l’accepteur et une diminution de la fluorescence du donneur. Ces signaux fluorescents à longue durée de vie peuvent être mesurés de manière à résolution temporelle et ratiométrique afin de réduire les interférences de dosage et d’augmenter la qualité des données. D’autres avantages du TR-FRET sont qu’il n’est pas sensible à la lumière, permet des lectures répétées et présente une longue stabilité du signal. Alors que TR-FRET est largement mis en œuvre dans HTS en raison de sa polyvalence, de sa sensibilité et de sa grande robustesse, toutes les plates-formes de dosage commerciales basées sur TR-FRET sont coûteuses, empêchant ainsi son large adoption dans les laboratoires universitaires et les petits laboratoires industriels. Le test LanthaScreen utilise également une lecture basée sur TR-FRET, mais repose sur une lignée cellulaire U2OS conçue qui exprime de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP)-STAT1 combinée à un anticorps STAT1 spécifique au phospho marqué au ^terbium8. En plus d’être limitée en termes de choix de protéines de signalisation, cette méthode nécessite l’achat de lignées cellulaires transfectées coûteuses, réduisant son applicabilité et augmentant la possibilité d’artefacts expérimentaux. Lumit est une plateforme générique d’immunodosage bioluminescent qui utilise des anticorps secondaires (anti-souris et anti-lapin) marqués chimiquement avec les petites et grandes sous-unités NanoBit de NanoLuc ^Luciferase9. La liaison de deux anticorps primaires à la protéine cible rapproche les anticorps secondaires pour former une enzyme active qui génère un signal de luminescence. Bien que la luminescence soit généralement une lecture sensible et robuste, l’exigence d’anticorps primaires soulevés chez deux espèces différentes limite les choix pour la conception du test. En outre, l’utilisation d’anticorps secondaires dans des matrices d’échantillons complexes peut être sujette à des interférences de dosage.

Ainsi, il existe toujours un besoin d’une plate-forme de dosage cellulaire fiable, rapide mais abordable pour mesurer les protéines STAT phosphorylées et totales individuelles d’une manière compatible avec HTS. Pour répondre à ce besoin, une nouvelle plateforme d’immunoessais cellulaires à haut débit a été développée sur la base d’une technologie TR-FRET améliorée (THUNDER) et conçue pour permettre une mesure simple, sensible, robuste et rentable des protéines intracellulaires exprimées de manière endogène (phosphorylées ou totales) dans les lysats cellulaires. Les avantages de cette technologie découlent de la combinaison d’une paire FRET donneur/accepteur présentant une compatibilité spectrale exceptionnelle et un signal TR-FRET, d’anticorps rigoureusement validés et de tampons de lyse optimisés. Ces tests sont formatés en tests immunologiques sandwich et utilisent un flux de travail simple en trois étapes (Figure 1). Les cellules sont d’abord traitées pour moduler la phosphorylation des protéines, puis lysées avec le tampon de lyse spécifique fourni dans le kit. La protéine STAT phosphorylée ou totale cible dans le lysat cellulaire est détectée en une seule étape d’ajout et d’incubation de réactif avec une paire d’anticorps marqués au fluorophore qui reconnaissent des épitopes distincts sur la protéine cible (Figure 2). Un anticorps est marqué avec un donneur de chélate d’europium (Eu-Ab1), tandis que le second anticorps est marqué avec un fluorophore accepteur rouge lointain (FR-Ab2). Les deux anticorps marqués se lient à la protéine en solution, ce qui rapproche les deux étiquettes. L’excitation du chélate d’europium donneur à 320 ou 340 nm déclenche un FRET vers l’accepteur, qui émet un signal TR-FRET à longue durée de vie à 665 nm proportionnel à la concentration de protéine cible (phosphorylée ou totale) dans le lysat cellulaire.

Figure 1 : Flux de travail du test TR-FRET. Le flux de travail se compose de trois étapes : le traitement cellulaire, la lyse cellulaire et la détection des protéines à l’aide de TR-FRET. Dans le protocole d’essai à deux plaques, les lysats sont transférés sur une plaque de détection blanche de 384 puits, tandis que dans le protocole à une plaque, toutes les étapes sont effectuées dans la même plaque de détection blanche de 384 puits (protocole tout-en-un). Quel que soit le protocole de dosage utilisé, la détection des protéines est effectuée dans le même volume total (20 μL par puits). Abréviation : TR-FRET = transfert d’énergie de résonance de Förster résolu dans le temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Principe du test immunologique en sandwich TR-FRET. Un anticorps est marqué avec le donneur de chélate d’Europium (Eu-Ab1) et le second avec le petit accepteur de fluorophore rouge lointain (FR-Ab2). Les deux anticorps marqués se lient spécifiquement à des épitopes distincts sur la protéine cible (phosphorylée ou totale) dans le lysat cellulaire, amenant les deux fluorophores à proximité. L’excitation du chélate d’europium donneur à 320 ou 340 nm déclenche une FRET du donneur vers les molécules acceptrices, qui à leur tour émettent un signal à 665 nm. Ce signal est proportionnel à la concentration de protéines dans le lysat cellulaire. En l’absence de la protéine cible spécifique, les fluorophores donneurs et accepteurs sont trop éloignés l’un de l’autre pour que fret se produise. Abréviations : FRET = transfert d’énergie de résonance de Förster ; TR-FRET = FRET à résolution temporelle; Ab = anticorps; FR = rouge lointain; Eu – chélate d’europium; P = phosphorylation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ici, des protocoles détaillés sont fournis pour mesurer, dans un format de puits 384, les niveaux intracellulaires de STAT1 phosphorylé (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) et STAT6 (Y641), ainsi que les totals STAT1, STAT3, STAT5 et STAT6, dans les lysats cellulaires des cellules adhérentes ou en suspension à l’aide de la plate-forme THUNDER TR-FRET. Ces protocoles définissent les étapes du traitement cellulaire, de la lyse et de la détection des protéines cibles basée sur TR-FRET à l’aide d’un protocole de transfert à deux plaques ou d’un protocole tout-en-un à une plaque. Ces tests cellulaires sont appliqués pour déterminer le profil pharmacologique des activateurs et inhibiteurs connus de la voie JAK/STAT. La robustesse et la pertinence de certains tests pour HTS sont démontrées. Enfin, des expériences clés pour l’optimisation des tests sont discutées, ainsi que des recommandations pour le dépannage des tests.