Tecniche di preparazione dei tessuti per l'imaging micromografico computerizzato con contrasto di modelli cardiaci di mammiferi di grandi dimensioni con malattia cronica

La preparazione di grandi cuori di mammiferi utilizzando il metodo di disidratazione e asciugatura all’aria rimuove tutto il contenuto di acqua dal campione. Prove di insufficiente sostituzione dell’acqua con etanolo possono essere osservate durante il caricamento di HMDS (vedere Protocollo, punto 4.4). La presenza di acqua sotto HMDS creerà bolle che salgono dal tessuto. In caso di livelli eccessivi di acqua, può verificarsi un aumento della temperatura del fluido di immersione. Mantenere la camera di immersione circondata dal ghiaccio durante il caricamento iniziale di HMDS può ridurre gli effetti negativi del riscaldamento dei tessuti. Dopo aver asciugato i cuori all’aria in assenza di mezzi di contrasto, il campione apparirà di colore bianco (vedere Protocollo, punto 4.6). La superficie esterna era spesso secca e strutturalmente stabile prima degli strati intramurali. Il risciacquo in etanolo prima del carico del mezzo di contrasto ha rimosso il deposito bianco (vedere Protocollo, punto 4.7). Affettare il tessuto usando una lama affilata rivela macroscopicamente singole fibre muscolari con una chiara separazione. Il carico di contrasto mediante immersione di campioni cardiaci in mezzo mezzo al mezzo di contrasto ha sofferto di artefatti limite di diffusione in regioni spesse e altamente muscolari del campione. Il carico di contrasto a diffusione sotto vuoto ha fornito una colorazione più omogenea nel muscolo (campione cardiaco n. 1, vedere Tabella 1 per i tempi di caricamento del mezzo di contrasto). Macroscopicamente, la distribuzione del mezzo di contrasto superficiale ha mostrato una colorazione in-omogenea tra il muscolo cardiaco e le regioni composte principalmente da componenti extracellulari, in particolare grasso e tessuto connettivo. I campioni di tessuto essiccati all’aria, prima o dopo il carico del mezzo di contrasto, hanno mantenuto un’integrità strutturale stabile. Il tempo necessario per scansionare l’intera larghezza del campione a una risoluzione di 20 μm in microCT utilizzando i parametri di scansione sopra menzionati e un tempo di esposizione di 1700 ms è stato di 6 h 34 min. A seconda delle dimensioni del campione nell’asse a portale dello scanner, questa durata è stata moltiplicata per il numero di posizioni necessarie per catturare l’intera lunghezza del campione. Per i cuori di maiale e pecora in questo studio, sono state utilizzate da tre a quattro posizioni. Il software NRecon ha affiancato le scansioni multi-posizione e offset per formare una singola immagine di proiezione a raggi X per ogni fase di rotazione della sorgente e del rivelatore a raggi X. In totale, 1000 proiezioni vengono memorizzate come immagini a 16 bit, generando 30-40 GB di dati. Le immagini volumetriche ricostruite erano 52-70 GB. I principali punti di riferimento anatomici, tra cui le cavità ventricolari, il setto e le pareti libere dei ventricoli, erano facilmente identificabili dall’imaging della trasmissione a raggi X di cuori di maiale essiccati all’aria macchiati con mezzo di contrasto mediante carico di diffusione (Figura 1A). Inoltre, sono state osservate anche regioni altamente strutturate che indicano l’organizzazione microstrutturale, come l’orientamento delle fibre miocardiche, a causa dell’attenuazione / trasmissione sensibile dei raggi X (Figura 1B). Le ricostruzioni tomografiche di volumi di immagini tridimensionali hanno mostrato una netta separazione tra tessuto e sfondo sia ai confini epicardici che endoteliali (Figura 1D). Per via intramurale, è stato osservato un basso contrasto e un gradiente di diffusione dell’intensità voxel in tutte le regioni transmurali spesse del tessuto. Nonostante ciò, la vascolarizzazione e le fibre miocardiche separate da piani di scissione erano ancora facilmente identificabili. Una seconda larghezza di banda di contrasto ad alta intensità è stata osservata allo strato più epicardico e nelle regioni sub-endocardiche punteggiate. Il miglioramento del contrasto è stato maggiore nei siti in cui sono stati accumulati componenti extracellulari, in particolare il tessuto connettivo epicardico, il grasso epicardico e la guaina del tessuto connettivo della rete di fibre di Purkinje. Le distribuzioni di intensità del segnale Voxel hanno mostrato un’elevata separazione dallo sfondo a intensità zero (aria) e da due popolazioni dominanti di tessuto a basso e alto contrasto (Figura 1D). Per convalidare il miglioramento del contrasto delle ricostruzioni di immagini microCT e la selettività ai compartimenti collagenosi dei campioni cardiaci, sono stati impiegati istologia, microscopia a campo luminoso e microscopia fluorescente (Figura 2). Un blocco transmurale di tessuto ventricolare da un cuore essiccato all’aria senza precedente carico di mezzo di contrasto è stato preparato per l’incorporamento e il sezionamento della paraffina. Le fette di tessuto adiacenti montate su vetrini del microscopio sono state trattate con la colorazione tricroma di Masson, nessun trattamento o 48 ore di PMA (1%). L’immersione di sezioni di tessuto montate su vetrino ha eliminato gli effetti del gradiente di diffusione del processo di colorazione osservato in campioni di cuore intero. La colorazione tricroma di Mason ha mostrato una colorazione collagen-positiva agli strati epiteliale ed endoteliale, perivascolarmente nel tessuto sub-epicardico, e una guaina di tessuto connettivo che circonda una fibra di Purkinje a corsa libera che sporge nella cavità ventricolare sinistra (Figura 2A). L’illuminazione del campo luminoso ha mostrato una colorazione più scura nelle strutture collagenose dopo la colorazione PMA, supportando l’accumulo preferenziale di PMA (Figure 2B, C). Inoltre, il trattamento con PMA ha precedentemente dimostrato di estinguere l’autofluorescenza dei complessi macromolecolari di collagene31. Le immagini fluorescenti delle sezioni di tessuto ventricolare avevano una perdita di fluorescenza indotta da PMA nei siti di collagene (Figura 2D vs 2E, Figura 2D’ vs 2E’ e Figura 2D” vs. 2E”). Sia nel campo luminoso che nell’imaging fluorescente, i compartimenti cellulari non sono stati alterati dal trattamento con PMA e il collagene ha avuto un accumulo selettivo di colorazione PMA e spegnimento dell’autofluorescenza. Il campione di cuore #2 è stato colorato con un mezzo di contrasto tramite perfusione prima dell’essiccazione all’aria. La ricostruzione dell’immagine ha rivelato una colorazione altamente irregolare all’interno del compartimento miocardico (Figura 3A). Il miglioramento del contrasto è apparso non selettivo della composizione tissutale, senza ulteriore miglioramento dell’intensità del segnale nelle regioni epicardica o sub-endocardica. Inoltre, il tessuto a basso contrasto ha mostrato una scarsa separazione dall’intensità di fondo (Figura 3B). La fibrosi ventricolare è stata indotta da infarto miocardico e ischemia cronica (campione cardiaco #3). Una cicatrice antero-apicale si è formata sostituendo i miociti con depositi di fibro-grasso nel tessuto a valle del sito di embolizzazione vascolare. Il campione di cuore #3 è stato preparato e ripreso da un cuneo ventricolare sezionato che copre il ventricolo anteriore sinistro, il setto e la parete libera ventricolare destra. La preparazione di questa configurazione del cuneo ventricolare è stata descritta in precedenza32 e l’applicazione di cunei per l’imaging cardiaco è stata esaminata in dettaglio33. La morfologia della cicatrice era transmurale ma eterogenea (Figura 4). Una lesione fibrotica densa centrale era circondata da una zona di confine sciolta ed eterogenea (Figura 4A). La preparazione ventricolare è stata macchiata mediante essiccazione post-aria a caricamento di diffusione e nel vuoto. La Figura 4B-E mostra le maggiori intensità di segnale dei volumi di immagini microCT ricostruite ai confini dei tessuti e alle regioni cicatriziali. I mezzi di contrasto hanno macchiato male il miocardio sano, ma il contrasto microstrutturale è stato mantenuto (Figura 4C’). Nella zona di confine, il tessuto cicatriziale era intervallato da miocardio sopravvissuto (Figura 4D’). La fibrosi densa appariva transmurale ma strutturata, indicando variazioni nella composizione (Figura 4E’). Le sezioni di tessuto di una regione ventricolare sinistra transmurale della preparazione tissutale essiccata all’aria e macchiata di PMA sono state utilizzate per convalidare la selettività della PMA per il collagene nel tessuto patologico confrontandola con la colorazione tricroma di Masson (Figura 4F). La colorazione della PMA era selettiva per il collagene (sub-epicardio e sub-endocardio) e assente nelle regioni del miocardio sopravvissuto (Figura 4G). Il campione di cuore #4 con fibrillazione atriale persistente indotta è stato essiccato all’aria conservando la forma nativa della cavità atriale. Il collasso dell’appendice atriale non è stato osservato. I principali punti di riferimento anatomici potrebbero essere identificati morfologicamente da immagini ricostruite (setto atriale, muscoli pectinati, seno coronarico, ostia venosa polmonare, vena cava e cristae terminalis). La colorazione per diffusione sotto vuoto ha provocato un miglioramento del contrasto nella radice aortica e nelle valvole atrioventricolari e nelle regioni discrete del miocardio funzionante. Il potenziamento della colorazione muscolare è stato limitato alle appendici atriali e alle pareti posteriori degli atri sinistro e destro (Figura 5). Figura 1: Imaging MicroCT di un cuore di maiale essiccato all’aria trattato con mezzo di contrasto PMA per diffusione sotto vuoto. (A) Immagine di proiezione a raggi X. (B) Un profilo di trasmissione estratto dalla linea rossa in A. (C) Fetta ad asse corto dei ventricoli da un volume tridimensionale ricostruito tomograficamente. Le frecce gialle indicano regioni puntiche di contrasto attribuite alle fibre di Purkinje sub-endocardiche. Le frecce blu indicano la vascolarizzazione. (D) Distribuzione dell’intensità del segnale della fetta di immagine ricostruita mostrata in C. LV: ventricolo sinistro e RV: ventricolo destro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Validazione della selettività della PMA per il collagene. (A) Colorazione tricroma di Masson di una sezione di tessuto transmurale dai ventricoli di un cuore essiccato all’aria. Il miocardio è colorato di rosso e il collagene è mostrato con colorazione verde. Le sezioni di tessuto adiacenti (B) assenti di colorazione o (C) macchiate con PMA (1%) sono state fotografate con illuminazione a campo luminoso per valutare l’uniformità della colorazione. (D) Le sezioni di tessuto assenti di colorazione o (E) macchiate da PMA sono state riprese al microscopio fluorescente. I pannelli D’ (scatola rossa solida) ed E’ (riquadro rosso tratteggiato) sono viste ingrandite del sub-epicardio per sezioni non macchiate e macchiate di PMA. I pannelli D” (scatola blu solida) ed E” (scatola blu tratteggiata) sono corrispondenti viste ingrandite del sub-endocardio e di una fibra di Purkinje a corsa libera. Le frecce indicano i siti di contenuto di collagene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Carico di perfusione di PMA prima dell’essiccazione all’aria e dell’imaging MicroCT. (A) Una fetta ad asse corto di un volume di immagine ricostruito dei ventricoli da un cuore di maiale. Le frecce blu indicano la vascolarizzazione. (B) La distribuzione dell’intensità del segnale della fetta di immagine dal pannello A. LV: ventricolo sinistro e RV: ventricolo destro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Imaging MicroCT di un cuore di pecora che soffre di un infarto miocardico cronico. (A) Si è formata una cicatrice densa nella regione apicale (vedi fotografia inserita). Una resa volumetrica della regione apicale da una prospettiva endocardica è stata assegnata alla colorazione in base all’intensità dell’immagine (rosso corrispondente al tessuto cicatriziale e al miocardio in verde). Le fette ortogonali dell’intensità della scala di grigi mostrano la distribuzione densa della cicatrice e il miocardio sopravvissuto confinante. La separazione tra tessuto fibrotico e miocardio corrisponde alle regioni del tessuto adiposo. (B) Una fotografia di una preparazione a cuneo ventricolare essiccata all’aria da una pecora con cicatrici apicali a seguito di infarto miocardico. Fette oblique del volume dell’immagine microCT ricostruita attraversano i ventricoli a livello medio tra base e apice e prossimali al sito di (C) occlusione vascolare (C- linea rossa nel pannello B), (D) la regione peri-infartuale confinante con cicatrice densa e miocardio sano (D- linea blu nel pannello B) e (E) una regione di fibrosi densa (E – linea verde nel pannello B). (C’) Una vista espansa della regione del setto delineata da una casella tratteggiata rossa in C. (D’) Una vista espansa della regione dell’infarto nell’apice ventricolare destro (riquadro tratteggiato blu nel pannello D). (E’) Una vista espansa della regione dell’infarto nell’apice ventricolare sinistro (riquadro tratteggiato verde nel pannello E). LV: Cavità ventricolare sinistra; RV: cavità ventricolare destra; MB: banda di moderatori; Pap: muscolo papillare. La freccia gialla indica l’arteria discendente anteriore sinistra. (F) La colorazione tricroma di Masson di una sezione istologica tagliata dal ventricolo sinistro essiccato all’aria macchiato di PMA. Il collagene è macchiato di blu e il miocardio è macchiato di rosa / viola. (G) Una sezione tissutale corrispondente della distribuzione della colorazione PMA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Immagine MicroCT di un cuore di pecora a seguito di fibrillazione atriale cronica indotta. (A) Una resa volumetrica degli atri con colorazione assegnata come nella Figura 4A. (B) Porzione di immagine microCT bi-atriale nell’asse lungo del cuore. Le fette ad asse corto sono state estratte a livello delle valvole atrioventricolari (C) (linea rossa C nel pannello B), (D) radice aortica (D- linea blu nel pannello B) e (E) tetto atriale sinistro (E- linea verde inpanel B). LA: atri di sinistra; RA: atri a destra; LAA: appendice atriale sinistra; RAA: appendice atriale destra; LV: ventricolo sinistro; RV: ventricolo destro; LVOT: tratto di deflusso ventricolare sinistro; RVOT: tratto di efflusso ventricolare destro e PA: arteria polmonare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Campione # 1 2 3 4 Specie Maiale Maiale Pecora Pecora Peso corporeo (kg) 32.4 31.2 47.2 53.4 Peso del cuore (g) 191.2 186.2 202.4 207.6 Patologia – – Infarto miocardico cronico Fibrillazione atriale cronica Preparazione del campione Tutto il cuore Tutto il cuore Cuneo del cuore anteriore Tutto il cuore Modalità di caricamento a contrasto Diffusione Perfusione Diffusione Diffusione Esposizione al mezzo di contrasto (h) 48 24 48 48 Tabella 1: Campioni di cuore e trattamento con mezzo di contrasto.