Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) is een krachtig hulpmiddel om de rol van het 18 kDa translocator eiwit of serotonine 5HT2A-receptorexpressie bij de ziekte van Alzheimer op cellulaire schaal te bestuderen. Dit protocol beschrijft de ex-vivo toepassing van FACS-RTT in het TgF344-AD rat model.
Gliacellen hebben waarschijnlijk een aanzienlijke implicatie in de pathofysiologie van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Hun veranderingen worden misschien geassocieerd met een pro-inflammatoire toestand. De TgF344-AD rattenstam is ontworpen om menselijke APP- en menselijke PS1ΔE9-genen tot expressie te brengen, coderend voor amyloïde eiwitten Aβ-40 en Aβ-42 en vertoont amyloïde pathologie en cognitieve tekorten bij veroudering. Het TgF344-AD rattenmodel wordt in deze studie gebruikt om de cellulaire oorsprong van de 18 kDa translocator eiwit (TSPO, een marker van gliacelactivatie) binding en de 5HT2A-receptor (5HT2AR) serotonine receptor niveaus die mogelijk verstoord zijn in AD te evalueren. De hier gepresenteerde techniek is Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), een kwantitatieve celtype-specifieke techniek die complementair is aan in vivo PET of SPECT of ex vivo/in vitro autoradiografietechnieken. Het kwantificeert dezelfde radioactief gelabelde tracer die eerder werd gebruikt voor beeldvorming, met behulp van een γ teller na cytometriecelsortering. Dit maakt het mogelijk om de cellulaire oorsprong van het radioactief gelabelde eiwit met hoge cellulaire specificiteit en gevoeligheid te bepalen. Studies met FACS-RTT toonden bijvoorbeeld aan dat (i) de toename van TSPO-binding geassocieerd was met microglia in een rattenmodel van lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde neuro-inflammatie, (ii) een toename van TSPO-binding na 12 en 18 maanden eerst geassocieerd was met astrocyten en vervolgens microglia in de TgF344-AD-ratten in vergelijking met wildtype (WT) ratten, en (iii) de striatale dichtheid van 5HT2A R neemt af in astrocyten na 18 maanden in hetzelfde rat AD-model. Interessant is dat deze techniek kan worden uitgebreid naar vrijwel alle radiotracers.
Neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer (AD), worden gekenmerkt door een neuronaal verlies geassocieerd met verhoogde symptomen. AD, de meest voorkomende oorzaak van dementie, goed voor 60% -70% van de gevallen, treft ongeveer 50 miljoen mensen wereldwijd1. Op neuropathologisch niveau zijn de twee belangrijkste kenmerken van AD de accumulatie van extracellulaire amyloïde-β (Aβ) plaques en intracellulaire Tau neurofibrillaire klitten. Gliacelveranderingen zijn ook in verband gebracht met AD2 en mogelijke verstoring van verschillende neurotransmittersystemen 3,4.
De TgF344-AD rattenlijn is aangepast naar model AD door menselijke APP- en PS1ΔE9-transgenen tot expressie te brengen, wat leidt tot oplosbare en onoplosbare Aβ-40- en Aβ-42-expressie en amyloïde plaquevorming5. Het presenteert ook de accumulatie van hyperfosforyleerde vormen van het Tau-eiwit die leiden tot tauopathie. Vanaf de leeftijd van 9-24 maanden ontwikkelen de ratten geleidelijk de pathologische kenmerken van AD en een cognitieve stoornis 5,6,7,8,9.
Positron Emission Tomography (PET), Single-Photon Emission computed Tomography (SPECT) en autoradiografie zijn technieken gebaseerd op de emissie en kwantificering van γ stralen. Radiotracers worden gekwantificeerd in vivo (PET en SPECT) of ex vivo/in vitro (autoradiografie). Die gevoelige technieken hebben bijgedragen aan het begrijpen van mechanismen van verschillende hersenziekten, zoals AD. Inderdaad, in termen van neuro-inflammatie zijn er veel studies die 18 kDa Translocator Protein (TSPO), een in vivo neuro-inflammatiemarker, beoordelen met radioactief gelabelde tracers zoals [11C] – (R) – PK11195 of [11C] PBR28 (voor beoordeling zie10). Bovendien zijn veranderingen van neurotransmittersystemen bestudeerd met behulp van radiotracers 11,12,13.
Die technieken bepalen echter niet de cellulaire oorsprong van het radioactieve signaal. Dit zou de interpretatie van de biologische onderbouwing van de verandering in de binding van een radioligand in PET/SPECT kunnen belemmeren. In het geval van TSPO-studies naar neuro-inflammatie is het bijvoorbeeld van het grootste belang om te begrijpen of de toename of afname van TSPO te wijten is aan astrocytische of microgliale veranderingen. De Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) techniek werd ontwikkeld om deze problemen te omzeilen, waardoor de beoordeling van radioligandbinding in elk celtype afzonderlijk en de kwantificering van de doeleiwitdichtheid per cel mogelijk is. Deze innovatieve techniek is bijgevolg complementair en zeer compatibel met PET- en SPECT-beeldvorming.
Hier werd deze techniek toegepast langs twee assen: de studie van neuro-inflammatie met behulp van TSPO-specifieke radioliganden en het beoordelen van het serotonerge systeem. Op de eerste as was het doel om de cellulaire oorsprong van het TSPO-signaal te begrijpen als reactie op een acute ontstekingsreactie. Daarom werd FACS-RTT gebruikt op de hersenweefsels van ratten na de inductie van neuro-inflammatie via een lipopolysaccharide (LPS) injectie en na een in vivo [125I] CLINDE SPECT beeldvormingsstudie. Verder werden dezelfde beeldvorming en hetzelfde FACS-RTT-protocol toegepast op 12- en 24 maanden oude TgF344-AD-ratten en bijpassende wild-type (WT) ratten. De tweede as was gericht op het bepalen van de oorsprong van serotoninerge systeemveranderingen in dit rattenmodel via ex vivo 5-HT2A R-dichtheidsbeoordelingper celtype.
Voor zover wij weten, was deze techniek de eerste die een benadering beschreef die een beter begrip mogelijk maakt van in vivo bindingsveranderingen van een radiotracer op cellulair niveau. Het protocol beschrijft een multischaalmethode om radiotracerbinding op cellulair niveau te kwantificeren met behulp van [125I]CLINDE (TSPO) of [125I]R91150 (5HT2AR) als voorbeelden.
Deze techniek is robuust en gevoelig genoeg om nauwkeurig de cellulaire oorsprong t…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (subsidie nr. 320030-184713). Auteurs BBT en KC worden ondersteund door de Velux Foundation (projectnr. 1123). Auteur ST kreeg steun van de Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr. P2GEP3_191446), de Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus scholarship) en de Jean and Madeleine Vachoux Foundation.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
HPLC | Knauer | ||
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
R91150 précursor | CERMN | ||
Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
Tributylin precursor | CERMN | ||
U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |