均質ビーズベースアッセイを用いたシャペロンコカペロン相互作用の研究

分子シャペロンは、タンパク質のフォールディング、輸送、分解など、タンパク質ホメオスタシスに寄与します。彼らはいくつかの細胞プロセスを調節し、癌や神経変性疾患などの多数の疾患にリンクされています¹.ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、その機能がATP加水分解によって駆動される立体構造変化に依存し、その共シャペロン²によって媒介されるクライアントタンパク質と結合する最も重要なシャペロンの1つである。治療目標としてHsp90の明らかな可能性にもかかわらず、その機能を微調整する大きな課題を表しています。N末端ATP結合領域を標的としたいくつかのHsp90阻害剤は臨床試験で評価されているが、いずれもマーケティングのために承認されていない^3。明確に定義されたリガンド結合ポケット⁴の欠如のために、Hsp90のC末端領域を標的にすることは、限られた成功^{を持っていた4.}近年、低分子によるHsp90-コカペロン相互作用の破壊が代替戦略⁵として検討されている。Hsp90-コカペロン相互作用を標的とすることは、一般的な細胞ストレス応答を引き出すものではなく、細胞内プロセスを特異的に調節する可能性を提供する。Hsp90のC末流で保存されたMEEVDペンタペプチドは、コシャペロン⁶のテトラトリコペプチド反復(TPR)モチーフとの相互作用を担う。ヒトタンパク質データベースにアポイントトされた736 TPRモチーフ含有タンパク質のうち、〜20種類の異なるタンパク質がこのペプチド⁷を介してHsp90と相互作用する。MEEVDペプチド結合を競合する分子は、TPRドメインを含むHsp90とコシャペロンとの相互作用を破壊するであろう。ペプチド結合部位は類似した三次構造を有するが、異なるTPRモチーフドメイン間の全体的な相同性は比較的低い⁷であり、Hsp90と特定のTPR-モチーフコシャペロンとの間の相互作用を特異的に遮断し得る分子を同定する機会を提供する。これらのTPR-モチーフコシャペロンの中でも、FK506結合タンパク質(FKBP)51およびFKBP52は、ステロイドホルモン受容体(SHR)シグナル伝達の調節因子であり、癌、ストレス関連疾患、代謝性疾患、およびアルツハイマー病⁸を含むいくつかのステロイドホルモン依存性疾患に関与する。FKBP51とFKBP52は80%の配列類似性>共有するが、それらの機能は異なる:FKBP52はSHR活性の肯定的な調節因子であり、FKBP51はほとんどの場合⁸において負の調節因子である。したがって、分子を同定し、Hsp90とFKBP51またはFKBP52との間の相互作用を特異的に遮断し、関連疾患に有望な治療可能性を提供する。

Mplified Luminescent PロキシミティH眼用Assay(アルファスクリーン)は、1994年にウルマンEFららによって最初に開発^{されました。}現在では、ペプチド^{10、タンパク質11、DNA12、RNA13、}糖¹⁴など、さまざまな種類の生物学的相互作用を検出するために広く使用されています。この技術では、ビーズの2種類(直径200nm)があり、一方がドナービーズ、もう1つがアクピコンドールビーズである。生体分子はこれらのビーズに固定化されています。彼らの生物学的相互作用は、ドナーとアクセクタービーズを近接させる。680 nmでは、ドナービーズの光化剤が酸素を点灯し、酸素を単一酸素に変換します。単一酸素は寿命が短いため、最大200nmまで拡散することしかできません。アクセクサビーズが近接している場合、そのチオキセン誘導体は、370nmで化学発光を生成する単一の酸素と反応する。このエネルギーは、520-620 nm¹⁵で発光する同じアクセプタビーズ内の蛍光体をさらに活性化する。生物学的相互作用が中断された場合、アクセプタービーズとドナービーズは近接に達することができず、その結果、単一の酸素崩壊および低生成信号が生じる。

ここでは、Hsp90とTPRコシャペロン、特にFKBP51およびFKBP52との相互作用を阻害する小分子をスクリーニングするためのこの技術を用いたプロトコルについて説明する。Hsp90極限C末端に対応する10アミノ酸長ペプチドは、アクセプタービーズに結合している。精製されたGSTタグ付きTPRコシャペロンは、グルタチオン結合ドナービーズと相互作用する。Hsp90由来ペプチドとTPR-モチーフコシャペロンとの相互作用がビーズを一緒に持ち込むとき、増幅シグナルが生成される(図1A)。スクリーニングされた小分子がHsp90とTPR-motifコシャペロンとの相互作用を阻害できる場合、この増幅シグナルは減少する(図1B)。それらの_IC50 は、定量測定により算出することができる。このプロトコルは、任意のシャペロンに拡張することができます – TPR-モチーフコシャペロン相互作用は、関心のある、新しい分子の開発において非常に重要であり、特にHsp90とFKBP51またはFKBP52間の相互作用を遮断する。

図1: 本アッセイの基本原理( A)精製 GST-FKBP51 はグルタチオン結合ドナービーズと相互作用する。Hsp90の極度C末端に対応する10アミノ酸長ペプチドは、アクセプタービーズに結合されている。FKBP51のHsp90由来ペプチドとTPRドメインとの相互作用は、ドナーとアクセプタービーズを近接させます。680 nmでは、ドナービーズの光化剤が酸素を点灯し、酸素を単一酸素に変換します。アクセプティクサビーズ上のチオキセン誘導体は、一重の酸素と反応し、370 nmで化学発光を生成します。このエネルギーは、520-620 nmで発光するために、同じアクセプタービーズ内のフルオロフォアをさらに活性化します。(B)小分子がHsp90とFKBP51の相互作用を阻害すると、ドナーとアクセプタービーズは近接に達することができない。その後、短い寿命の単一の酸素が崩壊し、検出可能な信号が生成されません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。