Untersuchungen von Chaperon-Cochaperon-Interaktionen mit homogenem Bead-based Assay

Molekulare Chaperone tragen zur Protein-Homöostase bei, einschließlich Proteinfaltung, Transport und Abbau. Sie regulieren mehrere zelluläre Prozesse und sind mit zahlreichen Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen verbunden¹. Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist eines der wichtigsten Chaperone, dessen Funktion von Konformationsänderungen abhängt, die durch ATP-Hydrolyse und Bindung an Client-Proteine, die durch seine Co-Chaperone vermittelt^{werden, angetrieben}werden 2 . Trotz eines offensichtlichen Potenzials von Hsp90 als therapeutisches Ziel stellt die Feinabstimmung seiner Funktion eine große Herausforderung dar. Es gibt mehrere Hsp90-Inhibitoren, die auf die N-terminale ATP-Bindungsregion abzielen, die in klinischen Studien untersucht wurden, aber keiner von ihnen wurde für die Vermarktung zugelassen³. Aufgrund des Fehlens einer gut definierten Ligandenbindungstasche⁴hatte das Targeting der C-terminalen Region von Hsp90 nur begrenzten Erfolg⁴. Kürzlich wurde die Störung von Hsp90-Cochaperon-Wechselwirkungen durch kleine Moleküle als alternative Strategie untersucht⁵. Die Ausrichtung auf die Hsp90-Cochaperon-Interaktionen würde keine allgemeine Zellstressreaktion hervorrufen und bietet die Möglichkeit, verschiedene intrazelluläre Prozesse spezifisch zu regulieren. Das konservierte MEEVD-Pentapeptid am C-Terminus von Hsp90 ist für die Wechselwirkung mit dem Tetratricopeptid-Wiederholungsmotiv (TPR) der Co-Chaperone verantwortlich^6. Von den 736 TPR-motivhaltigen Proteinen, die in der humanen Proteindatenbank annotiert sind, interagieren ~20 verschiedene Proteine über dieses Peptid mit Hsp90⁷. Moleküle, die um die MEEVD-Peptidbindung konkurrieren, würden die Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und Co-Chaperonen, die eine TPR-Domäne enthalten, stören. Die Peptidbindungsstelle hat eine ähnliche tertiäre Struktur, aber die Gesamthomologie zwischen verschiedenen TPR-Motivdomänen ist relativ niedrig⁷, was die Möglichkeit bietet, Moleküle zu identifizieren, die spezifisch in der Lage sind, Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und bestimmten TPR-Motiv-Co-Chaperonen zu blockieren. Unter diesen TPR-Motiv-Co-Chaperonen sind FK506-bindendes Protein (FKBP) 51 und FKBP52 Regulatoren der Steroidhormonrezeptor-Signalisierung (SHR) und an mehreren Steroidhormon-abhängigen Krankheiten beteiligt, darunter Krebs, stressbedingte Krankheiten, Stoffwechselerkrankungen und Alzheimer-Krankheit⁸. Obwohl FKBP51 und FKBP52 > Sequenzähnlichkeit von 80% teilen, unterscheiden sich ihre Funktionen: FKBP52 ist ein positiver Regulator der SHR-Aktivität, während FKBP51 in den meisten Fällen ein negativer Regulator ist⁸. Daher bietet die Identifizierung von Molekülen, die spezifisch Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKBP51 oder FKBP52 blockieren, ein vielversprechendes therapeutisches Potenzial für verwandte Krankheiten.

Einmplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) wurde erstmals 1994 von Ullman EF et al.⁹entwickelt. Jetzt wird es häufig verwendet, um verschiedene Arten von biologischen Interaktionen wie Peptid¹⁰, Protein¹¹, DNA¹², RNA¹³und Zucker¹⁴zu erkennen . Bei dieser Technik gibt es zwei Arten von Perlen (Durchmesser 200 nm), eine ist die Spenderperle und die andere ist die Akzeptorperle. Die Biomoleküle werden auf diesen Perlen immobilisiert; ihre biologischen Wechselwirkungen bringen Spender- und Akzeptorperlen in die Nähe. Bei 680 nm beleuchtet ein Photosensibilisator in der Spenderperle und wandelt Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff um. Da der Singsingstoff eine kurze Lebensdauer hat, kann er nur bis zu 200 nm diffundieren. Befindet sich die Akzeptorperle in der Nähe, reagiert ihr Thioxenderivat mit dem Singulett Sauerstoff, der bei 370 nm Chemilumineszenz erzeugt. Diese Energie aktiviert weiterhin Fluorophore in derselben Akzeptorperle, um Licht bei 520-620 nm¹⁵zu emittieren. Wenn die biologischen Wechselwirkungen gestört sind, können die Akzeptorperle und die Spenderperle keine Nähe erreichen, was zum Sauerstoffzerfall des Singuletts und zu einem schwach produzierten Signal führt.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das diese Technik zum Screening kleiner Moleküle verwendet, die Wechselwirkungen zwischen Hsp90- und TPR-Co-Chaperonen hemmen, insbesondere FKBP51 und FKBP52. Die 10 Aminosäuren langen Peptide, die Hsp90 extremem C-Terminus entsprechen, sind an Akzeptorperlen gebunden. Gereinigte GST-markierte TPR-Co-Chaperone interagieren mit Glutathion-verknüpften Spenderperlen. Wenn die Wechselwirkung zwischen Hsp90-abgeleiteten Peptiden und TPR-Motiv-Co-Chaperonen die Perlen zusammenbringt, wird ein verstärktes Signal erzeugt (Abbildung 1A). Wenn die gescreenten kleinen Moleküle die Wechselwirkungen zwischen Hsp90- und TPR-Motiv-Co-Chaperonen hemmen können, wird dieses verstärkte Signal verringert (Abbildung 1B). Ihr IC₅₀ kann durch quantitative Messung berechnet werden. Dieses Protokoll kann auf alle Chaperon-TPR-Motiv-Co-Chaperon-Interaktionen von Interesse erweitert werden und ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuartiger Moleküle, die insbesondere die Wechselwirkung zwischen Hsp90 und FKBP51 oder FKBP52 blockieren.

Abbildung 1: Das Grundprinzip dieses Assays. (A) Gereinigte GST-FKBP51 interagiert mit Glutathion-verknüpften Spenderperlen. Die 10 Aminosäuren langen Peptide, die dem extremen C-Terminus von Hsp90 entsprechen, sind an Akzeptorperlen gebunden. Die Interaktion zwischen Hsp90-abgeleiteten Peptiden und der TPR-Domäne von FKBP51 bringt die Spender- und Akzeptorperlen in die Nähe. Bei 680 nm beleuchtet ein Photosensibilisator in der Spenderperle und wandelt Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff um. Das Thioxenderivat auf der Akzeptorperle reagiert mit dem Singulett Sauerstoff und erzeugt eine Chemilumineszenz bei 370 nm. Diese Energie aktiviert weiterhin Fluorophore in derselben Akzeptorperle, um Licht bei 520-620 nm zu emittieren. (B) Wenn kleine Moleküle die Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKBP51 hemmen, können die Spender- und Akzeptorperlen keine Nähe erreichen. Dann zerfällt der Singulett-Sauerstoff mit kurzer Lebensdauer und es wird kein nachweisbares Signal erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.