慢性および急性イン ビボ 記録用炭素繊維微小電極アレイの構築と実装

すべての実験手順は、ブランダイス大学またはワシントン大学動物ケアと使用委員会によって承認されました.示されたデータは、1匹の雌フェレットと1匹の雄マウスから収集された。 炭素繊維・工具の製造 商業用炭素繊維の製造 エポキシサイズの繊維束から8cmのストリップを切ります。水片を円で平行に敷き、400°Cの窯で6時間焼き、市販の繊維からエポキシを取り除きます。次に、標準的なペトリ皿または円錐形の管に焼いた繊維を貯えます。注:直径7μmの繊維を使用しました。他のグループは4 μmの繊維20、21を使用している。 個々の繊維を保持するためのカセットを準備します。3D プリンタまたはレーザーカッターを使用して、カセットと関連するカセット ホルダーを作成します( 図 2を参照)。 カセットに繊維を積み込みます。カセットの2つの長い側面に両面テープを敷き、テープの端をカセットの内側の端に合わせることから始めます。個々の繊維を焼いた束から分離し、カセットの短い側と平行に置き、繊維間に2〜3mmを保ちます。各カセットに20~30本の繊維を装着してください。二重棒テープの上に透明なテープを敷いて、繊維を所定の位置に密封します。充填したカセットをカセットホルダーに入れる。注意:経験豊富なビルダーのために、繊維の1カセットを充填する場合は〜1時間かかります。初心者ビルダーの場合、このプロセスは〜1.5-3時間かかる可能性があります。箱に10カセットがあり、2つのカセットホルダーは、パリレン蒸着室に収めることができます。 市販の真空蒸着チャンバを使用して、個々の繊維にパリレンCを塗布します。コーティングには1回の実行が必要です。各ランの2.3gのパリレンを測定します。2つのカセットのホールダーは一度に部屋に入る。塗布の手順は、1回の実行につき約2時間かかります。注:2.3 gのパリレンCの測定は、コーティングのおよそ1 μmを提供します。被覆繊維は無期限に保存することができます。 炭素繊維操作ツールの作成 30G針の周りに柔軟な粘着フィルムの小片を包み、接着剤フィルムで鋭いが柔軟な点を形成する。注:針の先端をパラフィルムで包み、その際にパラフィルムを伸ばして、ユーザーが個々の繊維を拾って操縦することを可能にする穏やかな接着効果を生み出します。 2. 設計と製作 構築する電極の仕様に基づいて、必要な適切な治具設計を選択します。これは、必要なチャネル数と、設計の追加に基づいて行われます。注:ジグは、電極と電気接続のためのアンカーを提供する3Dプリントブロックを指します。 コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、ジグの特定の設計を作成または変更します。 高解像度の SLA 3D プリンターを使用して治具を印刷するには、3D 印刷会社または機関メーカーのラボを使用します。 3. 炭素繊維微小電極アレイ(CFEA)の組み立て 注:このステップは、経験豊富なビルダーのために〜2時間、初心者ビルダーのために〜6時間かかります。10xステレオ顕微鏡でCFEAアセンブリのステップと繊維の束縛のステップをすべて実行します。これは、建物のプロセスを妨げる可能性があるため、最小限の空気の動きで環境でCFEAを組み立てます。 望ましい電極を構築するために必要な適切な治具を選択してください。 金属ワイヤーカッターを使用して、直径0.003インチ(76.2 μm)のタングステン線2本を、長さ約7cmで切り取ります。 各ワイヤを、治具のコネクタ端にある適切なチャネルを通して供給します(GND および REF)。2つの端が等しい長さになるまで十分に供給し、それらを一緒にねじって治具に固定します。注: 16 チャンネルの急性設計では、金属ワイヤが治具のリッジ内に収まることを確認します。UV硬化歯科用セメントを適用してワイヤーを固定します。ワイヤーが通って供給される開いているチャネルの中で歯科用セメントを得ないようにしてください。注:ユーザーは、潜在的な目の損傷を防ぐために、すべてのUV関連の手順中にUVフィルタリングアイプロテクションを着用する必要があります。多くの UV 硬化杖には、表示フィルターが組み込まれています。 UV硬化杖を使用して、20 sの歯科用セメントを硬化させる。 ジグの腕の1つでジュエリーバイスのジグを固定します。側面の 1 つが地面に平行になるように、ジグの方向を設定します。 コネクタの端、洗面器、漏斗先端が見えるように、顕微鏡の下でジグと粘り角を向けます。じょうごがユーザーから離れ、コネクタの端がユーザーの向きに向かるように、治具の向きを変えます。 炭素繊維工具と鋭利な25G針を集める。 パリレン-Cコーティングされた繊維を含むカセットを白紙の上に置き、テープサイドを上に置き、繊維が紙の上に直接置かないようにします。 25G針を使用して、カセットから単一の炭素繊維を切断します。これを行うには、取り除く繊維が出てくるカセットに対して針の先端をスライドさせてください。 ハーフファイバーを使用して構築する場合は、上述のように繊維の一端を切断する。繊維をまっすぐに向け、針を使って、紙に対して繊維を切断して半分に切ります。カセットにまだ接続されている残りの半分をカットするために、以前に作られた炭素繊維工具で繊維の自由先端を保持し、針を使用して前述のようにカセットに接続された繊維を切断する。 フルファイバーを使用して構築する場合は、上述のように繊維の一方の端を切断します。以前に作られた炭素繊維ツールを使用し、ちょうど切断した繊維の自由端を保持します。針を使用して、カセットから繊維のもう一方の端を切り取ります。 以前に作られた炭素繊維ツールを使用して炭素繊維を拾います。一方の端部が工具から約1cmの長さを持たるようにファイバーを拾います。 ファイバーを取り付けた炭素繊維工具を使用し、ジグの中央流域から漏斗片を通して繊維の短い端を供給します。顕微鏡を使って視覚化します。 ファイバーの長さの大部分が終わるまで、ジグ漏斗を通して繊維を供給し続けます( 図3Aを参照)。 以前に作られた炭素繊維ツールを使用して、利用可能なチャネルを通してファイバーの背面部分を供給します。約5mmの繊維が背面に突き出るまで、繊維を背部に通します。必要に応じてサイズに切り取ります( 図 3Bを参照)。注: 金属ワイヤを含むチャネルにファイバーを供給しないでください。 上記の指示に従って、チャネルの残りの部分をジグの片側にファイバーで埋めます。注:漏斗に繊維を供給する場合は、右の分割のチャネルの右半分と左の分割のチャネルの左半分で、漏斗の各分割に繊維の半分を供給します。繊維が漏斗内で密接に接触している場合、既存の繊維が緩んだり壊れたりして、新しい繊維をジグに供給する際に、繊維間に好ましくない摩擦が発生します。この4つのセクションへの分割は、後のステップまで繊維が小さな束に保たれ、いくつかの救済を提供する。 標準のスパークホイールライターを使用し、コネクタの端にある露出したファイバーの上に炎をすばやく渡します。すべてのファイバーの絶縁材が両端で取り外されていることを確認します( 図3Cを参照)。注: 炎にさらされたファイバーの部分は、残りのファイバーよりもわずかに薄く見えるはずです。 炎に露出した繊維の部分がチャネル内に入るように、炎の繊維を治具に送ります。ジグの背面に繊維が突き出していないことを確認します( 図 3Dを参照)。注:カーボンファイバーツールを使用して、洗面器内から繊維をつかみ、炎の繊維を治具に送ります。この部分はより壊れやすいので、炎にさらされた繊維の部分に触れないでください。 治具の洗面器の繊維にUV硬化歯科用セメントを塗布します。チャネルの開口部と漏斗の開口部をカバーするために、流域全体を埋めます( 図 3Eを参照)。 UV光を使用し、20 sの歯科用セメントを硬化させる。歯科用セメントが完全に硬化していない場合は、追加の20 sを治療します。注:歯科用セメントがチャネル内を移動しないことを確認します。 ジグを万力から取り出し、ひっくり返し、以前に確保したように、ジグを万力で固定します。ファイバーを含む側が、今すぐ下向きになっていることを確認します。 上述のとおりに、ジグの空面に炭素繊維を充填します。 すべてのチャネルに繊維があって、繊維が歯科用セメントで固定されたら、ジグを万力から取り出し、ジグの向きを変えて漏斗が下を向いるようにします。コネクタの端が上向きになるように、フィス内のジグを固定します。 鋭利な25G針、1mLの注射器、銀導電性塗料、綿先端のアプリケーター、塗料シンナー、ティッシュワイプ、適切なヘッドステージコネクタを収集します。注:銀の導電性塗料が十分に混合され、均質なソリューションであることを確認してください。塗料を乾かさないで下してください。 0.3mLの銀色の塗料を1mLのシリンジに引き出し、鋭利な25G針を取り付けます。 歯科用セメントに止まるまで針を1つのチャネルに慎重に挿入します。チャネルから針を取り外しながらゆっくりとスポイトを押し下げ、チャネルをペイントで塗りつぶします( 図 3Eを参照)。 針から任意の塗料を拭き取り、次のチャネルに進みます。 すべてのチャンネルをペイントで塗りつぶします。注: 最初の数分間は、チャネルにペイント セットが設定されている場合、チャネルへの追加パスが必要になる場合があります。 塗料の薄い部分にコットンチップのアプリケーターを浸し、表面の任意の塗料の治具のベースをきれいにします。これには、いくつかの綿の先端のアプリケーターが必要な場合があります。注:塗料シンナーに浸さないコットンチップのアプリケーターは、治具をきれいにするのにも役立ちます。 ピンをチャンネルに合わせて適切な方向にヘッドステージコネクタを挿入します。ヘッドステージ コネクタが直立して、できるだけジグに対して高い位置にあることを確認します( 図 3Fを参照)。 治具を24時間治します。 ヘッドステージコネクタが治具と出会うエッジに沿って歯科用セメントを塗布することで、UV硬化デンタルセメントを使用して、ヘッドステージコネクタを治具に固定します。20 sのUV光を使用してUV硬化。 4. 繊維バンドル包装 注: この手順を実行するには約 30 分かかります。ピアマーターの厚い層を持つ動物モデルで使用される電極のためにこのステップを完了します。繊維束を補強して曲げを最小限に抑えます。マウスの手順では、この手順は必要ありません。 水張力を使用して、繊維の束を1本のシャフトにまとめます。電極が万力で直立して固定されている間、漏斗の先端からバンドル先端に水の滴を実行するために移管ピペットを使用してください。 じょうご先端の束の周りに厚さ約1.5mmの歯科用セメントの層を塗布することから始めます。20 sのUV光で歯科用セメントを硬化させろ。注: 皮質の録音のために、それ以上の包装は必要ありません。より深い脳領域については、バンドルの周りにガイドチューブを固定します。 ガイドチューブの構築とガイドチューブへのバンドルの挿入 ポリイミドチューブの所望の長さを測定し、カットします。ポリイミドチューブの長さが2mmの炭素繊維チップを自由に残すようにしてください。ポリイミドチューブより2mm短い30G金属チューブを測定してカットします。回転ツールを使用して、金属チューブの鋭いエッジを除去します。ポリイミドチューブを金属チューブの内側に挿入します。 カーボンファイバーバンドルを上向きにして、電極を万力に置きます。組み立てたチューブをマイクロマニピュレータに固定し、顕微鏡を使用して慎重に繊維束の上に下げます。歯科用セメントの追加層を使用して、既存の歯科用セメントベースにチューブを固定します。20 sのUV光で歯科用セメントを硬化させろ。注: ここで、構築プロセスを一時停止することができます。 5. 電極先端の準備 メモ:このステップを実行するには、アレイあたり約30分かかります。 電極を所望の長さに切ります。 電極先端を切る準備として、スタック付箋は、約1.5ミリメートルの高さプラットフォームを構築するために。プラットフォームの端から、所望の電極長さを測定し、この距離をマークします。プラットフォームは切断のためのガイドとして機能します。 漏斗先端が完全に水没するまで脱イオンまたは蒸留水のビーカーに電極を下げ、先端を先に、表面に垂直に保持する。水から電極を取り除くことによって、個々の炭素繊維を一緒に持って来ます。表面張力はバンドルを一緒に持って来る。電極を30分間空気乾燥させます。 #10メスブレードをハンドルに取り付けます。メスと電極を-18°Cの冷凍庫に5分以上入れて、凍結します。 ファイバーがガイドの表面にフラッシュされるように電極を置きます(ステップ5.1.1で用意)。転動を使用して、メスで目的の長さに繊維をカットします。電極とメスが凍結していることを確認するには、このステップを素早く完了してください( 図 3Gを参照)。 電極先端のインピーダンスを低減するために正の電流を注入します。 適切なアダプタを使用して、電極を多電極インピーダンステスターに取り付けます( 材料表を参照)。電極先端を0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)のマイクロ遠心チューブに約2mm下げる。マイクロ遠心分離管にアース線を挿入します。 選択した振幅と持続時間で電流を注入します。注: このステップは CFEA の先端のインピーダンス値を減らすことを目的としています。本研究では、次のパラメータが、エレクトロめっきソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースに入力されました: 現在: 0.100 μA;所要時間:10 s;一時停止: 1 s.このプロセスは、必要に応じて、電極インピーダンスが所望の値を満たすまで、チャネルごとに繰り返すことができます( 図4Cを参照)。 インピーダンス値が望ましいときは、繊維を脱イオンまたは蒸留水で洗い流して洗浄します。 金めっき液中の電気プレート。注:このステップは、移植の直前(同じ日)に行う必要があります。注意:CFEAチップの調製に使用される化学物質の一部は、金めっき液を含む腐食性です。使用前にSDSに相談し、ソリューションを安全に処理するために適切な予防措置を決定してください。注:繊維束に剛性を提供するために、ユーザは、最初に1mg/mLで脱イオンまたは蒸留水中のPEG8000を可溶化することによって金めっき溶液を作成することができる。次に、625 μL可溶化PEG8000と375 μLの金めっき液とボルテックス溶液を10 sに混合して混合します。PEG8000 は脳内の繊維の挿入後に溶解します。. 電極束先端をめっき混合物のマイクロ遠心チューブに2mm下げます。マイクロ遠心チューブに接地線を挿入します。 電気めっきに適切なパラメータを設定します。この研究では、次のパラメータが、エレクトロめっきソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースに入力されました: 現在: -0.05 μA;所要時間:30 s;一時停止:5 s. 繊維を脱イオンまたは蒸留水で十分に洗い流します。このとき、必要に応じてインピーダンス値を再度測定します。 6.脳内の挿入:生存手術、マウス(筋筋肉)と非生存手術、フェレット(ムスレ・プトリウス・フロ) 注: 外科手術は、IACUC に準拠した標準プロトコルに従う必要があります。詳細については、生存手術プロトコルのMaら22および非生存手術プロトコルのためのポポビッチら23を参照してください。げっ歯類の種の生存手術のためのASCガイドラインに従って無菌外科的処置に従ってください。これらには、135°Cで15分間の手術用ツールと材料のオートクレーブ、70%エタノールによる立体化装置と手術領域の治療が含まれます。手術中に滅菌手術用手袋、使い捨てガウン、フェイスマスクを使用してください。 サバイバル手術、マウス(筋筋肉) 2.5%のイオブルランを誘導ボックスに入れ、呼吸数が55~65呼吸/分になるまで麻酔します。次いで、2.0%のイオブルランを鼻コーンを介して投与し、麻酔を維持する。角膜損傷を防ぐために両眼に獣医軟膏を塗布する。つま先ピンチを実行して、麻酔の適切な程度を確認します。 検証後、Maら22に詳述されている生存手術手順に従ってください。呼吸数を監視し、60呼吸/分で維持します。サーモスタット制御の加熱パッドを使用して、37°Cで体温を維持します。頭蓋骨切り出し、尿素切診、電極注入のための頭蓋骨の準備手順については、手順6.3-6.5(下記の詳細)を参照してください。 手術後、マウスを回復ケージに戻し、37°Cの加熱パッドを備え、他の動物から分離する。 抗生物質軟膏の外科的創傷を覆う。彼らは胸骨の不備を維持し、彼らは2-5日間の期間の回復を可能にするのに十分な意識を取り戻すまで、動物を監視します。それらを一人で収容し、感染や不快感の兆候を継続的に監視します。動物に1回のブプレノルフィン72時間の持続放出(0.5-1.0 mg/kg)を鎮痛剤として手術当日に与える。 非生存手術、フェレット(ムスレ・プトリウス・フロ) 最初にケタミン(20mg/kg、i.m.)でフェレットを麻酔し、マスクを通して亜酸化窒素と酸素の2:1混合物で1.0%〜2.0%のイオブルランで換気する。つま先ピンチを実行して、麻酔の適切な程度を確認します。 検証後、ポポビッチら23で詳述された非生存手術手順に従ってください。気管切開術を行い、亜酸化窒素と酸素の2:1混合物でイソフルランの1.0%〜2.0%で動物を換気します。角膜損傷を防ぐために両眼に獣医軟膏を塗布する。 サーモスタット制御の加熱パッドを使用して、37°Cで体温を維持します。心拍数、終潮CO2 レベル、呼吸速度を監視します。呼吸率を適切な生理学的範囲(3.5%~4.0%)に保ちます。頭蓋骨切り出し、尿素切診、電極注入のための頭蓋骨の準備手順については、手順6.3-6.5(下記の詳細)を参照してください。 十分な麻酔を確実にするために動物のECGを継続的に監視し、ECGが何らかの苦痛を示すならばイオブルランの割合を増加させる。 実験の完了時に、1mLのペントバルビタールナトリウムおよびフェニトインナトリウム溶液をフェレットに投与し、心拍数および終潮CO2が0を測定するまで監視する。 頭蓋骨の準備 0.8 mmドリルバリを使用して、単一の4 mm x 4 mm 開出用の場所で開きます。マウスの場合は、ステンレス鋼のグランドスクリュー挿入のために、対側のサイトで追加のバリ穴を開けます。注:電極が移植の準備ができるまで、尿素検査を行わないで下さい。 地盤/基準を確立します。急性フェレット実験では、18Gの針を使用して、皮膚と頭蓋骨を取り巻く筋肉の層を、開頭術とは反対の動物の頭の側に突き刺す。Ag/Cl参照電極のワイヤーエンドを針先に挿入し、ペレットが筋肉と頭蓋骨の間にしっかりと座るように、針を筋肉/皮膚から引き込みます。マウスで、ステンレス製のアースネジにシルバーのアース線を巻き付けます。UV硬化歯科用セメントで安全。 薄いラベルテープを使用して電極を電極ホルダに取り付け、電極ホルダーをマイクロマニピュレータに固定します。アリゲーター クリップを使用してアース 線を接地ソースに接続します。動物の筋肉に埋め込まれた参照電極に参照ワイヤーを取り付けます。 デュロトミーとピアの浸透 硬膜摘みで頭蓋術から硬膜を取り除きます。 ピアに小さな穴を作成します。これを行うには、金属マイクロ電極(フェレットで推奨)を挿入し、撤回します。あるいは、CFEAを脳の表面に直交して下げて、脈管構造を避ける。この位置が決定されたら、電極を上げ、その位置の脳の表面を硬膜ピックで優しくニックし、ピックで上向きに引っ張ります(マウスで推奨)。 電極注入 電極先端を同じ位置に下げ、ファインモードで、電極を約2μm/sの速度で脳内に駆動し始めます。顕微鏡を使用して、電極がスムーズに入り、曲がらないようにします。注:電極がスムーズに入っていない場合は、脳から上げ、角度を再び再取り付けしてください。スムーズに入らずに曲がり続ける場合は、位置を調整し、新しいエントリ位置に対して脳の表面をニッキングするプロセスを繰り返します。 以下の手順で慢性および急性移植を行います。 慢性移植のために:UV硬化歯科セメントを使用して所定の位置に電極をセメント。 5-0外科縫合糸を使用して切開を閉じ、ヘッドキャップを構築します。 ヘッドキャップを構築するには、インプラント部位の周りに追加の歯科用セメントを追加します。治具の鼻を覆うことを確認してください。 ヘッドキャップの周りと皮膚を引き上げます。5-0外科縫合糸でヘッドキャップの後ろの切開を縫合する。 リドカインクリームと抗生物質軟膏を適用します。 麻酔薬を停止し、標準的な回復手順に従ってください。 急性移植の場合:電極を下げて所望の深さに達した後、電気生理学的記録を開始する前に少なくとも30分待って電極が所定の位置に落ち着くようにします。