Este protocolo describe un procedimiento para construir matrices de microelectrodos de fibra de carbono para registros electrofisiológicos in vivo crónicos y agudos en ratones(Mus musculus)y hurones(Mustela putorius furo) de múltiples regiones cerebrales. Cada paso, después de la compra de fibras de carbono en bruto para la implantación de matrices de microelectrodos, se describe en detalle, con énfasis en la construcción de matrices de microelectrodos.
Las matrices de electrodos multicanal ofrecen información sobre el cerebro en funcionamiento y sirven para dilucidar los procesos neuronales a nivel de una sola célula y circuito. El desarrollo de estas herramientas es crucial para comprender los comportamientos complejos y la cognición y para avanzar en las aplicaciones clínicas. Sin embargo, sigue siendo un desafío registrar densamente de las poblaciones celulares de manera estable y continua durante largos períodos de tiempo. Muchos electrodos populares, como los tetrodos y las matrices de silicio, presentan grandes diámetros cruzados que producen daño al insertarse y provocan respuestas tisulares reactivas crónicas asociadas con la muerte neuronal, lo que dificulta el registro de una actividad neuronal estable y continua. Además, la mayoría de los haces de cables exhiben un amplio espaciado entre canales, lo que impide la grabación simultánea de un gran número de células agrupadas en un área pequeña. Las matrices de microelectrodos de fibra de carbono descritas en este protocolo ofrecen una solución accesible a estas preocupaciones. El estudio proporciona un método detallado para fabricar matrices de microelectrodos de fibra de carbono que se pueden utilizar tanto para registros agudos como crónicos in vivo. Las propiedades físicas de estos electrodos los hacen ideales para grabaciones estables y continuas a largo plazo a altas densidades celulares, lo que permite al investigador realizar grabaciones robustas e inequívocas de unidades individuales a lo largo de meses.
Los electrodos y las matrices de electrodos son herramientas valiosas para comprender cómo el cerebro procesa la información a nivel neuronal. Si bien los registros electrofisiológicos han sido alcanzables durante más de dos siglos1, todavía no es posible medir simultáneamente la actividad de circuitos neuronales completos a la resolución espacial y temporal requerida para capturar el pico de neuronas individuales. Aunque los métodos no invasivos, como la electroencefalografía2,la topografía de emisión de positrones3y la resonancia magnética funcional4 permiten mediciones de todo el cerebro, no pueden lograr la resolución espacial y temporal necesaria para resolver la actividad de los circuitos neuronales2,5. Por el contrario, los métodos de imagen como las imágenes ópticas que utilizan colorantes sensibles al voltaje o los indicadores de calcio codificados genéticamente pueden lograr una resolución espacial de una sola unidad, pero plantean problemas como la baja resolución temporal y la mala selectividad3,4,5,6. Las grabaciones eléctricas son una poderosa alternativa a estos métodos. Los electrodos de grabación proporcionan una resolución temporal sin precedentes y permiten al usuario realizar mediciones con precisión de tiempo de pico en cualquier región del cerebro7. Además, las matrices multielectrodos implantadas crónicamente (MEA) permiten registros a gran escala (decenas a cientos de células) de una sola célula en animales que se comportan durante un período de días ameses 8,9. Sin embargo, las sondas de silicio que registran a densidades más altas tienen una gran huella y son altamente invasivas, y las matrices implantadas crónicamente a menudo generan una respuesta de inflamación, encapsulación de tejidos y muerte neuronal10,11,12,13.
Las limitaciones de los electrodos existentes han dado lugar a innovaciones recientes que permiten grabaciones estables, de alta resolución y a largo plazo. Los electrodos típicos consisten en un conductor metálico, como tungsteno o platino-iridio, o son a base de silicio o polímero. Si bien las matrices de microcables a base de metal pueden mantener grabaciones estables a largo plazo, tienen una huella mucho mayor, con un diámetro de un solo cable que oscila entre 10 y 200 μm14. Por el contrario, las matrices de electrodos basadas en silicio producen grabaciones con alta resolución espacial, pero debido a su diseño relativamente rígido, generalmente no pueden mantener la señal y grabar desde las mismas neuronas durante muchosmeses 15. Los desarrollos recientes en matrices basadas en silicio han dado como resultado electrodos que pueden realizar grabaciones crónicas de manera confiable, pero estas matrices no se pueden usar para grabar desde regiones cerebrales profundas en animales más grandes y están destinadas a grabaciones lineales9. Los avances en las matrices de polímeros han dado como resultado una mayor flexibilidad y estabilidad de registro de unidades individuales y ofrecen el potencial de grabaciones de alta densidad en un futuro próximo, pero con una disponibilidad limitada en la actualidad8,16,17. Las fibras de carbono permiten grabaciones de alta densidad con materiales listos para usar que se describen aquí.
Los microelectrodos de grabación de fibra de carbono se han utilizado durante décadas, con los primeros electrodos de fibra de carbono que consisten en una sola fibra de carbono insertada en una micropipeta de vidrio. Estos microelectrodos se utilizaron para grabaciones extracelulares de una sola unidad, y aunque la relación señal-ruido era comparable a los mejores microelectrodos de tungsteno en vidrio, eran ventajosos debido a su flexibilidad, valores de impedancia más bajos y simplicidad para fabricar18,19. Los esfuerzos para desarrollar matrices de electrodos de fibra de carbono se han acelerado recientemente debido a las capacidades de biodetección de las fibras de carbono. Además de su mayor biocompatibilidad y conductividad eléctrica excepcional, cuentan con un conjunto único de propiedades, que incluyen resistencia a altas temperaturas, baja densidad relativa, alta resistencia a la tracción, baja rigidez a la flexión, alta sensibilidad de detección y una pequeña área de sección transversal10,12. Todas estas propiedades han motivado el desarrollo de matrices de microelectrodos de fibra de carbono (CFEA) que facilitan los registros crónicos, estables y de alto rendimiento de neuronas individuales. Tales CFEA ahora se pueden elaborar a mano20, 21(Figura 1),produciendo matrices de microelectrodos que pueden contener neuronas individuales durante meses. Aquí se describe un proceso de construcción accesible para los CFEA que se ha adaptado de dos maneras para registros agudos y crónicos de neuronas individuales en dos especies.
Este protocolo describe cada paso necesario para construir un ACG funcional tanto para uso agudo como crónico. El proceso descrito es personalizable a las necesidades del investigador, por lo que es una opción accesible y económica para monitorear neuronas individuales durante meses. El protocolo demuestra la viabilidad de registrar tanto la actividad robusta de una sola unidad a los pocos minutos de la implantación en un animal anestesiado, como a lo largo de cuatro meses en un animal despierto y de comportamiento, lo que ilustra el potencial de estos CFEA para estudiar los cambios a corto y largo plazo en las respuestas neuronales.
Los pasos del protocolo descritos han sido probados a fondo y mejorados con el tiempo para producir un procedimiento eficiente que se puede completar rápidamente, a un bajo costo marginal (< $ 100.00), con la capacidad de registrar unidades individuales inequívocas, densa y estable durante meses. Los pasos de construcción se pueden completar en menos de un día y producirán señales electrofisiológicas que son comparables a cualquier matriz comercial líder. Los CFEA también tienen una huella mucho más pequeña (el haz de fibras de 16 canales tiene un diámetro de ~ 26 μm) que las matrices comerciales similares, y su biocompatibilidad las hace adecuadas para el uso a largo plazo13. Es importante destacar que hay varios pasos e instrucciones críticas que deben seguirse para producir un CFEA funcional con un rendimiento comparable.
Debido a la fragilidad de las fibras de carbono, deben manejarse con el máximo cuidado. Manipularlos con pinzas afiladas u otras herramientas puede provocar la rotura de las fibras. Además, es importante construir los CFEA en un espacio con movimiento de aire limitado para que las fibras no se desvanezcan. Al quemar la parte posterior de las fibras, el encendedor solo necesita moverse en un movimiento de ida y vuelta muy brevemente, durante aproximadamente 1 s. Los pasos que siguen a esta eliminación del aislamiento son cruciales para construir un electrodo con canales de trabajo. Las puntas flameadas deben introducirse en la plantilla sin ningún contacto adicional. Luego, al llenar el lavabo con cemento dental, es importante que el cemento se aplique cuidadosamente y llene completamente los canales y el recipiente del embudo, cerrando las aberturas sin llenarlas. El cemento dental debe curarse completamente con luz UV antes de continuar. Una vez que esto se haya completado, se debe inyectar pintura plateada en cada canal hasta que esté completamente lleno, pero sin derramarse. Este es el paso más variable en el proceso. Cualquier llenado excesivo puede producir diafonía entre canales, y un llenado insuficiente puede provocar una falla en la conexión. Si no puede inyectar pintura plateada con una aguja de 25 G, es probable que la solución sea demasiado viscosa y, en este caso, se puede agregar una pequeña cantidad de diluyente de pintura para crear una solución más fluida. Una vez que se llenan todos los canales y se inserta el conector del cabezal, es importante permitir que la matriz se cure durante 24 h antes de asegurar el conector con cemento dental. Descubrimos que el hecho de no hacerlo redujo el número de canales conectados. La aplicación de una cantidad generosa de cemento dental también es importante para que el conector no se desconecte al interactuar con el sistema de adquisición de señal. Si se desprenden, es posible intentar la reconexión con el llenado repetido de canales con pintura plateada, pero el usuario debe probar los valores de impedancia del CFEA para evaluar el número de canales conectados. Permitir que el cemento dental se cure durante la noche también sirve para prevenir posibles desprendimientos.
La medición de la impedancia del electrodo proporcionará una estimación precisa de los canales conectados. Esto se puede hacer después de sumergir los cables de tierra y referencia y las puntas de fibra de carbono en PBS. Hemos observado que una alta impedancia (>15 MΩ) es indicativa de un canal abierto y no conectado. Antes de inyectar corriente y galvanoplastia, un canal conectado puede tener un rango de valores de impedancia que deberían disminuir significativamente con este proceso. El número promedio de canales conectados (impedancia < 4 MΩ después de la inyección de corriente) por electrodo de 16 canales fue de 12,96 ± 2,74 (promedio ± SD; N = 48 electrodos). Se probaron varios tiempos de galvanoplastia, y 30 s produjeron un aislamiento de señal superior entre los sitios de grabación(Figura 5). Si bien se ha establecido bien que PEDOT-pTS12,24,25,26 y PEDOT-TFB21 proporcionan opciones confiables para preparar sitios de grabación de fibra de carbono, encontramos que el chapado con oro, un método probado y confiable para galvanoplastia electrodos para implantación crónica27,28 , aumentó la facilidad de implantación y evitó que las puntas de los electrodos se aglutinaran. Al producir valores de impedancia final de menos de 0,2 MΩ en promedio, este método resulta comparable a los valores alcanzados utilizando PEDOT-TFB21 y PEDOT-pTS26.
Al implantar la matriz de microelectrodos, es importante seguir visualmente la inserción de las puntas de fibra de carbono bajo el microscopio. La inserción exitosa debe ser evidente, sin flexión de las fibras. Si las fibras parecen estar pandeándose, es poco probable que entren con éxito en el cerebro. En este caso, el ángulo de la sonda debe ajustarse para un segundo intento. Este proceso puede continuar hasta que la inserción de la sonda sea exitosa. Una vez que el electrodo está a la profundidad deseada, hemos encontrado que esperar al menos 30 minutos permitirá que la sonda se conforme con la adquisición óptima de la señal (grabaciones agudas).
Los CFEA descritos, además de su pequeña huella y biocompatibilidad, ofrecen una alternativa robusta y personalizable a las matrices comerciales debido a su facilidad de construcción y bajo costo. La mayor limitación a los CFEA detallados en este protocolo es su escalabilidad. Debido a la naturaleza manual de su construcción, escalar a diseños con cientos de sitios de grabación puede no ser práctico. Además, los avances en la fabricación de matrices de microelectrodos utilizando nanotecnología permitirán registros de población a mayor escala que los métodos descritos aquí. Sin embargo, este protocolo ofrece accesibilidad CFEA a los laboratorios interesados en la fabricación de electrodos de fibra de carbono. No observamos pérdida de estabilidad o disminución de la robustez en la amplitud del pico durante la duración de los experimentos crónicos de 120 días, como lo indica un canal único representativo típico de nuestras observaciones en esa escala de tiempo(Figura 6A–E). Además, los CFEA muestran la capacidad de actividad persistente de una sola unidad, ya que cuatro unidades individuales permanecieron discernibles 11 meses después de la implantación enratones (Figura 6G,H). También es posible obtener grabaciones estables de una sola unidad de forma aguda(Figura 7),lo que ofrece una ventaja sobre muchos otros electrodos comerciales para el estudio de neuronas individuales en períodos cortos de tiempo. En el futuro, el desarrollo de estas sondas flexibles y biocompatibles con diámetros mínimos permitirá el estudio de procesos complejos. Estas herramientas proporcionarán una utilidad sustancial en el avance de la tecnología neuronal, incluidas las aplicaciones en interfaces cerebro-máquina (IMC), que requieren estabilidad continua a largo plazo29.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Greg Guitchounts por su orientación con el diseño y la construcción de electrodos y a Tim Gardner por abrirnos su laboratorio e instalaciones. Nos gustaría agradecer a Christos Michas por su ayuda con el uso de PDS en las instalaciones centrales de Bio-Interface and Technology y a Neil Ritter, Jon Spyreas y David Landesman por su ayuda en el diseño de las primeras versiones de la plantilla de 16 canales. Nos gustaría agradecer a Tim Cavanaugh por su ayuda con las imágenes SEM en el Centro de Sistemas de Nanoescala de Harvard en Harvard.
#10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool – sharp-tipped |
30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Deionized water | Electroplating component | ||
Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
JRClust | Ferret spike sorting software | ||
Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
Sticky notes | Post-it | Building tool | |
Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |