이 프로토콜은 여러 뇌 영역에서마우스(Mus musculus)및 페렛(무스텔라퍼토리우스 후로)의 만성 및 급성 생체 내 전기 생리학적 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전기 전극 어레이를 구성하는 절차를 설명합니다. 미전지어 어레이 이식에 대한 원시 탄소 섬유를 구입한 후 각 단계는 미세 전기 전하 배열 구조에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.
다중 채널 전극 배열은 작동 뇌에 대한 통찰력을 제공하고 단일 세포 및 회로 수준에서 신경 과정을 해명하는 역할을합니다. 이러한 도구의 개발은 복잡한 행동과 인식을 이해하고 임상 응용 프로그램을 발전시키는 데 매우 중요합니다. 그러나, 그것은 오래 된 기간 동안 지속 적으로 안정적으로 지속적으로 세포 인구에서 조밀 하 게 기록 하는 도전 남아. 테트로데 및 실리콘 어레이와 같은 많은 인기 있는 전극은 삽입 시 손상을 생성하고 신경 죽음과 관련된 만성 반응성 조직 반응을 유도하는 큰 교차 직경을 특징으로하며 안정적이고 지속적인 신경 활동의 기록을 방해합니다. 또한, 대부분의 와이어 번들은 작은 영역에 클러스터된 많은 수의 세포로부터 동시 레코딩을 배제하면서 채널 간의 광범위한 간격을 나타낸다. 이 프로토콜에 설명된 탄소 섬유 마이크로 전기 전지 배열은 이러한 문제에 대한 접근 가능한 솔루션을 제공합니다. 이 연구는 생체내 급성 및 만성 기록 모두에 사용할 수 있는 탄소 섬유 미세 전조 배열을 제작하는 상세한 방법을 제공한다. 이 전극의 물리적 특성은 높은 세포 밀도에서 안정적이고 지속적인 장기 기록에 이상적하므로 연구원은 수개월에 걸쳐 단일 단위에서 견고하고 모호한 기록을 만들 수 있습니다.
전극 및 전극 배열은 뇌가 신경 수준에서 정보를 처리하는 방법을 이해하는 데 중요한 도구입니다. 전기 생리학적 기록은 2세기 이상 달성되었지만1년이상 달성되었지만, 개별 뉴런의 급증을 포착하는 데 필요한 공간 및 측두해상도에서 전체 신경 회로의 활성을 동시에 측정하는 것은 여전히 불가능합니다. 뇌전도2,양전자 방출 지형3,기능성 자기 공명 영상4와 같은 비침습적 방법은 뇌 의 전뇌 측정을 허용하지만, 신경 회로 의활성을해결하는 데 필요한 공간 및 측두적인 해상도를 달성할 수 없다2,5. 대조적으로, 전압에 민감한 염료 또는 유전자 인코딩된 칼슘 지표를 이용한 광학 이미징 과 같은 이미징 방법은 단일 단위 공간 해상도를 달성할 수 있지만, 낮은 시간적 해상도 및 가난한 선택성3,4,5,6과같은 문제를 제기한다. 전기 기록은 이러한 방법에 대한 강력한 대안입니다. 전극을 기록하면 비교할 수 없는 시간 적 해상도를 제공하며, 사용자는 뇌7의모든 영역에서 스파이크 타임 정밀도로 측정할 수 있습니다. 또한, 만성 이식된 다중 전극 어레이(MEA)는 수일에서 달8,9까지동물에서 극대형(수십~수백 개의 세포), 단일 세포 기록을 가능하게 한다. 그러나, 더 높은 밀도에서 기록하는 실리콘 프로브는 큰 발자국을 가지고 있고 매우 침습적이며, 만성 이식 배열은 종종 염증 반응, 조직 캡슐화 및 신경 사10,11,12,13을생성한다.
기존 전극의 한계는 안정적이고 고해상도의 장기 기록을 허용하는 최근의 혁신을 초래했습니다. 전형적인 전극은 텅스텐 또는 백금 이리듐과 같은 금속 도체로 구성되거나 실리콘 또는 폴리머 기반입니다. 금속 기반 마이크로와이어 어레이는 장기적이고 안정적인 레코딩을 유지할 수 있지만, 단일 와이어의 직경은 10-200 μm14에이르는 훨씬 더 큰 설치 공간을 갖는다. 대조적으로, 실리콘 기반 전극 어레이는 높은 공간 해상도로 기록을 산출하지만, 상대적으로 경직된 설계로 인해 일반적으로 수개월 동안 동일한 뉴런에서 신호및 기록을 유지할 수 없다15. 실리콘 기반 어레이의 최근 개발은 안정적으로 만성 기록을 수행 할 수있는 전극의 결과, 그러나 이러한 배열은 큰 동물의 깊은 뇌 영역에서 기록하는 데 사용할 수 없으며 선형 기록9을위한것입니다. 폴리머 어레이의 발전으로 단일 유닛의 유연성과 레코딩 안정성이 향상되고 가까운 장래에 고밀도 레코딩의 잠재력을 제공하지만 현재8,16,17에서제한된 가용성을 제공합니다. 탄소 섬유는 여기에 설명된 기성품 재료로 고밀도 레코딩을 허용합니다.
탄소 섬유 기록 마이크로 전극은 수십 년 동안 사용되어 왔으며, 단일 탄소 섬유로 구성된 최초의 탄소 섬유 전극이 유리 마이크로 파이프에 삽입되었습니다. 이러한 미세 전극은 단일 단위 세포 외 기록에 사용되었으며 신호 대 잡음 비율이 최고의 텅스텐 인 유리 마이크로 전극과 비교할 수 있었지만 유연성, 낮은 임피던스 값 및18,19을제조하는 단순성으로 인해 유리했습니다. 탄소 섬유 전극 어레이 를 개발하기 위한 노력은 최근 탄소 섬유의 바이오 센싱 기능으로 인해 가속화되었습니다. 생체 적합성 증가 및 뛰어난 전기 전도도 외에도 고온 저항, 낮은 상대밀도, 높은 인장 강도, 낮은 굴곡 강성, 높은 검출 감도 및 작은 단면 영역10,12를포함한 독특한 특성 세트를 특징으로 합니다. 이러한 모든 특성은 단일 뉴런의 만성, 안정적이고 고수량 기록을 용이하게 하는 탄소 섬유 미세 전기 전체 어레이 (CFEA)의 개발에 동기를 부여했습니다. 이러한 CFEA는 이제 수개월 동안 단일 뉴런을 보유할 수 있는 마이크로 전극 어레이를 산출하는손 20,21(그림 1)으로제작될 수 있다. 여기에 설명된 CFEA에 대한 접근 가능한 건설 과정은 두 종에서 개별 뉴런의 급성 및 만성 기록을 위한 두 가지 방법으로 적응되었습니다.
이 프로토콜은 급성 및 만성 사용에 대한 기능적 CFEA를 구성하는 데 필요한 각 단계를 설명합니다. 설명 된 과정은 연구원의 요구에 사용자 정의 할 수 있습니다, 그것은 개월 동안 단일 뉴런을 모니터링하기위한 접근하고 저렴한 옵션을 만들기. 이 프로토콜은 마취된 동물에서 이식 후 몇 분 이내에 강력한 단일 단위 활성을 모두 기록할 수 있는 타당성을 보여주고, 깨어 있는 4개월 동안 동물을 행동하며, 신경 반응의 단기 및 장기 변화를 연구할 수 있는 이러한 CFEA의 잠재력을 보여줍니다.
설명된 프로토콜의 단계는 시간이 지남에 따라 철저하게 테스트되고 개선되어 몇 달 동안 눈에 띄지 않는 단일 유닛을 조밀하고 안정적으로 기록하는 능력으로 낮은 한계 비용(<$100.00)으로 신속하게 완료할 수 있는 효율적인 절차를 산출했습니다. 시공 단계는 하루 이내에 완료 할 수 있으며 모든 주요 상용 어레이에 필적하는 전기 생리학적 신호를 생성합니다. CFEA는 또한 유사한 상용 어레이보다 훨씬 작은 발자국(16채널 섬유 번들 직경 ~26 μm)을 가지며, 생체 적합성은 장기사용(13)에적합합니다. 중요한 것은 비슷한 성능을 갖춘 기능 CFEA를 생성하기 위해 따라야 하는 몇 가지 중요한 단계와 지침이 있다는 것입니다.
탄소 섬유의 취약성으로 인해 최대한 주의를 기울여 처리해야합니다. 날카로운 집게 또는 다른 도구로 처리하면 섬유가 파손될 수 있습니다. 또한, 섬유가 날아가지 않도록 공기 움직임이 제한된 공간에서 CFEA를 구성하는 것이 중요합니다. 섬유의 뒤쪽 부분을 불태우면 라이터는 약 1s의 앞뒤로 움직여야 합니다. 절연의이 제거 다음 단계는 작업 채널전극을 구성하는 데 중요합니다. 화염 팁은 추가 접촉없이 지그로 공급해야합니다. 그런 다음, 치과 시멘트로 분지를 채울 때, 시멘트가 조심스럽게 적용되고 채널과 깔때기 분지를 완전히 채우고, 이를 채우지 않고 개구부를 닫는 것이 중요합니다. 치과 시멘트는 진행하기 전에 UV 빛으로 완전히 경화되어야합니다. 이 작업이 완료되면, 실버 페인트는 완전히 채워질 때까지 각 채널에 주입해야하지만 유출되지 않아야합니다. 이 단계는 프로세스에서 가장 가변적인 단계입니다. 오버 필링하면 채널 간에 상호 토크가 발생할 수 있으며 충전이 부족하면 연결 오류가 발생할 수 있습니다. 25G 바늘을 사용하여 은페인트를 주입할 수 없는 경우 용액이 너무 점성이 있고, 이 경우 소량의 페인트 희석제를 첨가하여 보다 유동적인 용액을 생성할 수 있다. 모든 채널이 채워지고 헤드 스테이지 커넥터가 삽입되면 치과 시멘트로 커넥터를 확보하기 전에 배열이 24 시간 동안 치료할 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 그렇게 하지 않으면 연결된 채널 수가 감소하는 것으로 나타났습니다. 충분한 양의 치과 시멘트를 적용하는 것도 중요하며 신호 획득 시스템과 상호 작용할 때 커넥터가 연결이 끊어지지 않도록 합니다. 분리될 경우 은페인트로 반복되는 채널 채우기로 다시 연결을 시도할 수 있지만 사용자는 CFEA의 임피던스 값을 테스트하여 연결된 채널 수를 평가해야 합니다. 치과 시멘트가 하룻밤 동안 치료하도록 허용하는 것은 잠재적 인 분리를 방지하는 역할을합니다.
전극의 임피던스를 측정하면 연결된 채널의 정확한 추정을 제공합니다. 이것은 PBS에서 지상 및 기준 전선 및 탄소 섬유 팁을 침수 한 후 수행 할 수 있습니다. 우리는 높은 임피던스 (>15 MΩ)가 개방형 연결되지 않은 채널을 나타내는 것을 관찰했습니다. 전류 및 전기 도금을 주입하기 전에 연결된 채널은 이 프로세스를 통해 크게 감소해야 하는 임피던스 값의 범위를 가질 수 있습니다. 16채널 전극당 커넥티드 채널(임피던스 < 4MΩ)의 평균 수는 12.96± 2.74(평균 ± SD; N = 48 전극). 다수의 전도 횟수를 테스트하였고, 30s는 기록 사이트 들 사이에서 우수한 신호 절연을 생산하였다(도5). PEDOT-pTS12,24,25, 26및 PEDOT-TFB21이 탄소 섬유 녹음 사이트를 준비하기위한 신뢰할 수있는 옵션을 제공한다는 것이 잘 확립되었지만, 만성 이식용 전극을 전자도금으로 검증되고 신뢰할 수있는 방법인 금으로 도금하는 것을발견했습니다(27,28) , 이식의 용이성을 증가하고 전극 팁이 함께 뭉쳐방지. 평균 0.2MΩ 미만의 최종 임피던스 값을 생성할 때 이 방법은 PEDOT-TFB21 및 PEDOT-pTS26을사용하여 달성된 값과 비교할 수 있음을 증명합니다.
마이크로 전극 어레이를 이식할 때 현미경으로 탄소 섬유 팁의 삽입을 시각적으로 따르는 것이 중요합니다. 성공적인 삽입은 섬유의 구부러지지 않고 명백해야 합니다. 섬유가 좌굴처럼 보이면 뇌에 성공적으로 들어갈 가능성은 거의 없습니다. 이 경우 두 번째 시도를 위해 프로브각도를 조정해야 합니다. 이 프로세스는 프로브 삽입이 성공할 때까지 계속될 수 있습니다. 전극이 원하는 깊이에 도달하면, 우리는 적어도 30 분 기다리는 것이 프로브가 최적의 신호 수집 (급성 기록)에 정착 할 수 있음을 발견했습니다.
CFEA는 작은 발자국과 생체 적합성 외에도 건설용성과 저렴한 비용으로 인해 상업용 어레이에 대한 강력하고 사용자 정의 가능한 대안을 제공합니다. 이 프로토콜에 자세히 설명된 CFEA에 대한 가장 큰 제한은 확장성입니다. 구조의 수동 특성으로 인해 수백 개의 녹음 사이트로 설계를 확장하는 것이 실용적이지 않을 수 있습니다. 또한 나노 기술을 이용한 미세 전기 전하 배열 제조의 발전은 여기에 설명된 방법보다 대규모 인구 기록을 가능하게 합니다. 그러나 이 프로토콜은 탄소 섬유 전극의 벤치탑 제작에 관심이 있는 실험실에 CFEA 접근성을 제공합니다. 우리는 120 일 만성 실험의 기간 동안 스파이크 진폭의 안정성 또는 감소 견고성의 손실을 관찰하지, 그 시간 규모에 우리의 관측의 전형적인 대표 단일 채널에 의해 표시(그림 6A–E). 또한, CFEA는 4개의 단일 단위가 마우스에 이식된 후 11개월 동안 식별가능한 상태로 남아 있기 때문에 지속적인 단일 단위 활성에 대한 용량을 보여준다(그림 6G,H). 또한 짧은 기간 동안 단일 뉴런연구를 위해 다른 많은 상용 전극에 비해 이점을 제공하는 안정적인 단일 단위기록(도 7)을얻을 수도 있다. 미래에는 직경이 최소한의 유연한 생체 적합성 프로브를 개발하면 복잡한 공정을 연구할 수 있습니다. 이러한 도구는 뇌-기계 인터페이스(BMI)의 응용 을 포함하여 신경 기술의 발전에 상당한 유용성을 제공 할 것이며, 이는 연속적이고 장기적인안정성(29)을필요로 한다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 전극 설계 및 건설과 팀 가드너와 함께 지도에 대한 그렉 Guitchounts감사하고 싶습니다 우리에게 자신의 실험실과 시설을 열어. 우리는 바이오 인터페이스 및 기술 핵심 시설에서 PDS 사용에 대한 그의 도움 크리스토스 미하스와 닐 리터, 존 스파이레아스, 데이비드 랜데스만에게 16 채널 지그의 초기 버전을 설계하는 데 도움을 주셔서 감사합니다. 하버드 나노스케일 시스템 센터의 SEM 이미징에 대한 팀 카바나우의 도움을 주신 것에 감사드립니다.
#10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool – sharp-tipped |
30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Deionized water | Electroplating component | ||
Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
JRClust | Ferret spike sorting software | ||
Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
Sticky notes | Post-it | Building tool | |
Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |