该协议描述了一种构建碳纤维微电极阵列的程序,用于从多个大脑区域对小鼠(肌肉肌肉)和雪貂(Mustela putorius furo)进行慢性和急性体内电生理记录。在购买原碳纤维到微电极阵列植入后,每个步骤都进行了详细描述,重点是微电极阵列的构建。
多通道电极阵列提供对工作大脑的洞察,并用于阐明单细胞和电路水平的神经过程。这些工具的开发对于理解复杂的行为和认知以及推进临床应用至关重要。然而,在很长一段时间内稳定和连续地从细胞群中密集记录仍然是一个挑战。许多流行的电极,如四极管和硅阵列,具有大的交叉直径,在插入时产生损伤,并引发与神经元死亡相关的慢性反应组织反应,阻碍稳定,连续的神经活动的记录。此外,大多数线束在通道之间表现出较宽的间距,无法同时记录聚集在小区域中的大量细胞。该协议中描述的碳纤维微电极阵列为这些问题提供了一种可访问的解决方案。该研究提供了一种制造碳纤维微电极阵列的详细方法,可用于 体内急性和慢性记录。这些电极的物理特性使其成为在高细胞密度下稳定和连续的长期记录的理想选择,使研究人员能够在几个月内从单个单元进行稳健,明确的记录。
电极和电极阵列是了解大脑如何在神经元水平上处理信息的宝贵工具。虽然电生理学记录已经实现了两个多世纪1,但仍然不可能以捕获单个神经元尖峰所需的空间和时间分辨率同时测量整个神经回路的活动。虽然非侵入性方法,如脑电图2,正电子发射形貌3和功能磁共振成像4允许全脑测量,但它们不能达到解决神经回路活动所需的空间和时间分辨率2,5。相比之下,使用电压敏感染料或遗传编码钙指示剂的光学成像等成像方法可以实现单单位空间分辨率,但它们带来了诸如时间分辨率低和选择性差等问题3,4,5,6。电气记录是这些方法的强大替代方案。记录电极提供无与伦比的时间分辨率,并允许用户在大脑的任何区域以尖峰时间精度进行测量7。此外,长期植入的多电极阵列(MEAs)能够在几天到几个月的时间内在行为动物中实现大规模(数十至数百个细胞)的单细胞记录8,9。然而,以较高密度记录的硅探针具有较大的足迹并且具有高度侵入性,并且长期植入的阵列通常产生炎症反应,组织封装和神经元死亡10,11,12,13。
现有电极的局限性导致了最近的创新,这些创新允许稳定,高分辨率,长期记录。典型的电极由金属导体组成,例如钨或铂铱,或者是硅基或聚合物基的。虽然基于金属的微线阵列可以保持长期稳定的记录,但它们的占地面积要大得多,单线的直径范围为10-200μm14。相比之下,硅基电极阵列产生具有高空间分辨率的记录,但由于其相对严格的设计,它们通常无法在许多个月内保持来自相同神经元的信号和记录15。硅基阵列的最新发展已经产生了可以可靠地执行慢性记录的电极,但这些阵列不能用于记录大型动物的深部大脑区域,并且用于线性记录9。聚合物阵列的进步提高了单个单元的灵活性和记录稳定性,并在不久的将来提供了高密度记录的潜力,但目前可用性有限8,16,17。碳纤维允许使用此处描述的现成材料进行高密度记录。
碳纤维记录微电极已经使用了几十年,第一个碳纤维电极由插入玻璃微量移液器中的单个碳纤维组成。这些微电极用于单单元细胞外记录,尽管信噪比与最好的玻璃钨微电极相当,但它们具有优势,因为它们具有灵活性,较低的阻抗值和制造简单性18,19。由于碳纤维的生物传感能力,最近加快了开发碳纤维电极阵列的努力。除了增加的生物相容性和优异的导电性外,它们还具有一系列独特的性能,包括耐高温,低相对密度,高拉伸强度,低弯曲刚度,高检测灵敏度以及小横截面积10,12。所有这些特性都推动了碳纤维微电极阵列(CFEA)的发展,这些阵列有助于单个神经元的长期,稳定,高产量记录。这种CFA现在可以手工制作20,21(图1),产生可以在几个月内容纳单个神经元的微电极阵列。这里描述的是CFEA的可访问构建过程,该过程已以两种方式适用于两个物种中单个神经元的急性和慢性记录。
该协议描述了为急性和慢性使用构建功能性CFEA所需的每个步骤。所描述的过程可根据研究人员的需求进行定制,使其成为在几个月内监测单个神经元的可访问且廉价的选择。该协议证明了在麻醉动物植入后几分钟内记录强大的单单元活动以及在清醒,行为正常的动物中记录四个月的稳健单单元活动的可行性,说明了这些CFEA研究神经反应的短期和长期变化的潜力。
所描述的协议的步骤已经过彻底的测试和改进,以产生一个有效的程序,可以快速完成,以较低的边际成本(<100.00美元),并能够在几个月内密集和稳定地记录明确的单个单元。施工步骤可以在不到一天的时间内完成,并将产生可与任何领先的商业阵列相媲美的电生理信号。与类似的商业阵列相比,CFEA还具有更小的占地面积(16通道纤维束的直径约为26μm),并且它们的生物相容性使其适合长期使用13。重要的是,必须遵循几个关键步骤和说明,才能产生具有可比性能的CFEA。
由于碳纤维的脆弱性,必须非常小心地处理它们。用锋利的镊子或其他工具处理它们可能会导致纤维断裂。此外,重要的是在空气流动有限的空间中构建CFA,以便纤维不会被吹走。当燃烧纤维的后部时,打火机只需要非常短暂地来回移动,大约1秒。去除绝缘层后的步骤对于构建具有工作通道的电极至关重要。火焰尖端应送入夹具中,不要再接触。然后,当用牙科水泥填充盆时,重要的是要小心地涂覆水泥并完全填充通道和漏斗盆,关闭开口而不填充它们。然后,在继续之前,应用紫外线完全固化牙科水泥。一旦完成,银漆应注入每个通道,直到完全填充但不会溢出。这是该过程中变化最大的步骤。任何过度填充都会在通道之间产生串扰,填充不足都可能导致连接失败。如果无法使用25 G针注入银漆,则可能是溶液太粘稠,在这种情况下,可以添加少量的油漆稀释剂以产生更流畅的溶液。一旦所有通道都填满,并且头台连接器入,在用牙科水泥固定连接器之前,让阵列固化 24 小时是很重要的。我们发现,如果不这样做,就会减少连接通道的数量。应用大量的牙科水泥也很重要,这样连接器在与信号采集系统连接时不会断开连接。如果它们脱落,可以尝试用银色油漆反复填充通道重新连接,但用户应测试CFEA的阻抗值以评估连接通道的数量。让牙胶在一夜之间固化也有助于防止潜在的脱落。
测量电极的阻抗将提供对连接通道的准确估计。这可以在将接地和参考线以及碳纤维尖端浸入PBS后完成。我们观察到,高阻抗(>15 MΩ)表示通道开路。在注入电流和电镀之前,连接的通道可以具有一系列阻抗值,这些阻抗值应随此过程而显着降低。每个16通道电极的平均连接通道数(电流注入后阻抗<4 MΩ)为12.96±2.74(平均±SD;N = 48 个电极)。测试了多次电镀时间,30 s在记录站点之间产生了优异的信号隔离(图5)。虽然已经确定PEDOT-pTS 12,24,25,26和PEDOT-TFB 21为制备碳纤维记录位点提供了可靠的选择,但我们发现镀金是一种经过验证的可靠方法,用于长期植入的电镀电极27,28,增加了植入的便利性,并防止电极尖端聚集在一起。在产生平均小于0.2 MΩ的最终阻抗值时,该方法被证明与使用PEDOT-TFB21和PEDOT-pTS26实现的值相当。
当植入微电极阵列时,重要的是在显微镜下目视跟随碳纤维尖端的插入。成功插入应是显而易见的,纤维不会弯曲。如果纤维看起来是屈曲的,它们不太可能成功进入大脑。在这种情况下,应调整探头的角度以进行第二次尝试。此过程可以继续进行,直到探头插入成功。一旦电极达到所需的深度,我们发现等待至少30分钟将使探头稳定下来,以实现最佳信号采集(急性记录)。
所描述的CFA除了占地面积小和生物相容性外,还因其易于构建和低成本而为商业阵列提供了一种强大,可定制的替代方案。该协议中详述的 CFEA 的最大限制是其可扩展性。由于其构造的手动性质,扩展到具有数百个记录站点的设计可能不切实际。此外,使用纳米技术制造微电极阵列的进步将使比这里描述的方法更大规模的群体记录成为可能。然而,该协议为对碳纤维电极的台式制造感兴趣的实验室提供了CFEA的可访问性。在120天的慢性实验期间,我们没有观察到峰值幅度的稳定性损失或鲁棒性降低,正如我们在该时间尺度上观察到的代表性单通道典型所示(图6A–E)。此外,CFEA显示了持续单单元活动的能力,因为在小鼠植入11个月后,四个单单元仍然可识别(图6G,H)。也可以敏锐地获得稳定的单单元记录(图7),这为在短时间内研究单个神经元提供了优于许多其他商业电极的优势。将来,开发这种具有最小直径的柔性,生物相容性探针将使复杂过程的研究成为可能。这些工具将为神经技术的进步提供实质性的实用性,包括脑机接口(BMI)中的应用,这需要连续,长期的稳定性29。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢Greg Guitchounts在电极设计和构造方面的指导,并感谢Tim Gardner向我们开放他的实验室和设施。我们要感谢Christos Michas在Bio-Interface and Technology核心设施中使用PDS的协助,以及Neil Ritter,Jon Spyreas和David Landesman在设计16通道夹具的早期版本中的帮助。我们要感谢Tim Cavanaugh在哈佛大学纳米级系统中心的SEM成像方面的帮助。
#10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool – sharp-tipped |
30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Deionized water | Electroplating component | ||
Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
JRClust | Ferret spike sorting software | ||
Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
Sticky notes | Post-it | Building tool | |
Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |