概要

Mesures de transfert d’énergie par résonance de Förster dans des cellules végétales vivantes

Published: June 28, 2021
doi:

概要

Un protocole est prévu pour la mise en place d’un microscope confocal à balayage laser standard pour les mesures in vivo de transfert d’énergie par résonance de Förster, suivies d’une évaluation des données.

Abstract

Les expériences de transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) basées sur des émissions sensibilisées sont faciles à réaliser, mais dépendent de la configuration microscopique. Les microscopes confocaux à balayage laser sont devenus un cheval de bataille pour les biologistes. Les systèmes commerciaux offrent une grande flexibilité dans le réglage de la puissance laser et la sensibilité du détecteur et combinent souvent différents détecteurs pour obtenir l’image parfaite. Cependant, la comparaison des données basées sur l’intensité de différentes expériences et configurations est souvent impossible en raison de cette flexibilité. Les procédures conviviales pour les biologistes sont avantageuses et permettent un réglage simple et fiable des réglages du laser et du détecteur.

De plus, comme les expériences FRET dans des cellules vivantes sont affectées par la variabilité de l’expression des protéines et des rapports donneur-accepteur, les niveaux d’expression des protéines doivent être pris en compte pour l’évaluation des données. Décrit ici est un protocole simple pour des mesures FRET fiables et reproductibles, y compris des routines pour l’estimation de l’expression des protéines et l’ajustement de l’intensité laser et des paramètres du détecteur. L’évaluation des données sera effectuée par étalonnage avec une fusion de fluorophores de l’efficacité FRET connue. Pour améliorer la simplicité, des facteurs de correction ont été comparés qui ont été obtenus dans les cellules et en mesurant des protéines fluorescentes recombinantes.

Introduction

Le transfert d’énergie de résonance de Förster ((F)RET) est généralement observé par spectroscopie de fluorescence, bien que le processus lui-même ne se limite pas à se produire entre les fluorophores. Le couplage dipôle-dipôle sous-jacent nécessite simplement une molécule donneuse émettant de la lumière et un accepteur absorbant la lumière. Ceci est dérivé de l’intégrale de chevauchement spectral requise J des spectres normalisés d’émission du donneur et d’absorbance de l’accepteur1. Cependant, comme le RET est en concurrence avec la fluorescence, le transfert d’énergie devient mesurable par des altérations de l’émission de fluorescence : le RET induit la trempe du donneur et l’émission d’accepteur sensibilisé.

Le RET à base de fluorophore a été appelé transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET) pour le séparer du transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET). Le RET dépend fortement de la distance entre le donneur et l’accepteur, qui est largement comprise entre 0,5 et 10 nm2 et donc dans la même gamme que les dimensions des protéines et de leurs complexes. Deuxièmement, RET dépend de l’orientation dipôle-dipôle kappa au carré. Combiné au fait que la liberté de rotation des fluorophores liés aux protéines peut être négligée en raison du poids moléculaire et de la relaxation rotationnelle lente, RET permet l’analyse des altérations conformationnelles3.

Le rayon de Förster est basé sur l’intégrale du chevauchement spectral et la gamme de longueurs d’onde du chevauchement, de sorte que les chromophores absorbant la lumière rouge entraînent des rayons de Förster plus longs que les colorants absorbant la lumière bleue. Comme la plage dynamique des mesures FRET est limitée de 0,5 × R0 et de 1,5 × R0, la paire FRET ECFP-EYFP a une plage dynamique de 2,5 à 7,3 nm en raison de son R0 de 4,9 nm4.

La luminosité d’un fluorophore est donnée par le produit de son coefficient d’extinction molaire et de son rendement quantique. Pour les mesures FRET, il est avantageux de choisir des fluorophores de luminosité presque similaire. Cela améliore la détection de la trempe du donneur et de l’émission d’accepteurs sensibilisés. Il favorise également l’étalonnage du système de microscopie. En regardant les paires FRET fréquemment utilisées de protéines cyan et fluorescentes, la luminosité plus faible des protéines fluorescentes cyan devient évidente (Figure 1A).

Cependant, la durée de vie de l’accepteur doit être inférieure à la durée de vie du donneur, ce qui garantit la disponibilité de l’accepteur pour le transfert d’énergie. Si la durée de vie de l’accepteur dépasse la durée de vie du donneur, l’accepteur peut encore être dans l’état excité lorsque le donneur est à nouveau excité. Les protéines fluorescentes cyan avancées telles que mTurquoise montrent une durée de vie prolongée et contribuent ainsi à une probabilité accrue de FRET (Figure1B). La probabilité de FRET dépend également du coefficient d’extinction molaire de l’accepteur.

Protocol

REMARQUE: Pour le protocole suivant, une transfection transitoire des protoplastes a été effectuée, comme décrit précédemment12. Une brève description est donnée ci-dessous. 1. Transfection transitoire des protoplastes Couper ~4 g de feuilles saines de l’écotype Columbia d’Arabidopsis thaliana en tranches de 1 mm et les transférer dans 20 mL de solution enzymatique (1,5 % de cellulase ; 0,4 % de macérozyme ; 0,1 % d’albumine sérique …

Representative Results

Réglage du microscope confocal à balayage laserLe réglage laser a révélé une augmentation linéaire de l’émission avec une augmentation de l’intensité du laser (figure 2 et tableau 1). Comme prévu pour les lasers argon-ion, l’émission de la ligne de 514 nm était beaucoup plus élevée que l’émission de la ligne de 458 nm, comme en témoigne une pente plus raide. Pour les expériences ultérieures, une puissance laser de 4,5% et 6,5% a…

Discussion

La trempe du donneur et l’émission d’accepteur sensibilisée sont caractérisées par une relation linéaire qui permet le calcul du FRET basé sur le donneur ou l’accepteur. Les facteurs de linéarité correspondants sont appelés facteur G (donneur à accepteur) ou xi (accepteur à donneur), qui sont des valeurs réciproques4. La mesure de FRET entre les protéines fluorescentes par microscopie à fluorescence nécessite souvent des corrections pour le DSBT et l’ASBT en raison des large…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les expériences ont été réalisées à la plate-forme technologique de microscopie optique (LiMiTec) de la Faculté de biologie de l’Université de Bielefeld. Ce travail a été financé par l’Université de Bielefeld.

Materials

8-well slides Ibidi 80821
Immersion oil Immersol  W2010 Zeiss 444969-0000-000 refraction index of water
LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope Zeiss
LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope Zeiss

参考文献

  1. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).
  2. Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it’s done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
  3. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
  4. Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
  5. Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
  6. Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
  7. Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
  8. Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
  9. Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
  10. Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
  11. Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
  12. Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
  13. Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
  14. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).

Play Video

記事を引用
Schmidtpott, S. M., Seidel, T. Förster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells. J. Vis. Exp. (172), e62758, doi:10.3791/62758 (2021).

View Video