Çift Florofor Oranımetrik Mikroskopi kullanılarak Makropinozomların pH, Redoks Kimyaları ve Bozunabilir Kapasitesinin Ölçülmesi

Makropinositoz, makropinozomlar^1,2adı verilen membran bağlı sitoplazmik organellere büyük miktarlarda hücre dışı sıvı alımını ifade eder. Amip Diktyostelium sppgibi serbest yaşayan tek hücreli organizmalar tarafından gerçekleştirilen son derece korunmuş bir süreçtir. ³, yanı sıra antozooans⁴ ve metazoans². Çoğu hücrede makropinositoz indüklenen bir olaydır. Hücre yüzeyi reseptörlerinin ligasyonu, fırfırlar olarak adlandırılan aktin tahrikli plazma membran uzantılarının çıkıntısını teşvik eder. Bu fırfırların bir kısmı, bazı kötü anlaşılmış mekanizma tarafından, makropinozom oluşturmak için distal uçlarını mühürler (bu yöntem kağıdının kapsamının ötesinde, makropinositoz mekaniği hakkında ayrıntılı incelemeler için, lütfen 1^,2 ,^5,6,7referanslarına bakın). Makropinositozu indükleyen hücre dışı uyaran en sık çözünür bir büyüme faktörüdür^5,8. Buna göre, makropinositik olay, hücrenin büyümeyi kolaylaştırmak için yararlı metabolitler türetebileceği hücre dışı malzeme bolusunun yutulmasını sağlar. Ne yazık ki, besin dağıtımı için bu yol patolojiyi de yönlendirebilir. Bazı kanser hücreleri, sürekli veya konssitütif makropinositoz ile sonuçlanan mutasyonları barındırır. Besinlerin sürekli verilmesi kanser hücrelerinin kontrolsüz çoğalmasını kolaylaştırır ve özellikle agresif tümörler⁹, 10^,11^,12,13ile bağlantılıdır. Benzer şekilde, virüsler konak hücrelere erişmek için makropinositozu teşvik edebilir, böylece viral patolojiyi yönlendirebilir¹⁴.

Makropinositoz ayrıca patojenlere karşı bağışıklığın korunmasında da işlev gösterir. Makrofajlar ve dendritik hücreler gibi bazı doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, makropinositoz 6^,15^,16yoluyla hücre dışı sıvının constitutive ve agresif örneklemesine girer. Bu makropinositoz modu inanılmaz derecede aktiftir ve tek bir dendritik hücre, her saat kendi ağırlığına eşdeğer bir hücre dışı sıvı hacmi ile kendini engorge edebilir¹⁷. Bu konsitültasyonel örneklemeye rağmen, makrofajlar ve dendritik hücreler tümör hücreleri gibi kontrolsüz bir şekilde çoğalmazlar, bunun yerine hücre dışı materyali potansiyel tehditlerin varlığını veya gerçekten yokluğunu bildirmek için bilgi çıkarılacak şekilde işliyor gibi görünürler. Bilgiler i) hücre içi patojen tanıma reseptörleri tarafından okunabilen patojen ilişkili moleküler desenler ve ii) uyarlanabilir bağışıklık sisteminin hücreleri tarafından taranmaya hazır başlıca histocompatibility moleküllerine yüklenebilen kısa amino asit esnemeleri¹⁶,^18,19olarak çıkarılır. Patojenlerin bağışıklık hücreleri tarafından bilgi işleme için bu yolu altüst edip etmediği şu anda belirsizdir.

Makropinositoz için hem bağışıklık hem de homeostazın sürdürülmesinde ve daha yaygın olarak çalışılan diğer endositoz modlarının aksine, makropinozomların iç (luminal) çalışmalarının çok azı bilinmektedir. Makropinozomların armatür biyokimyasını incelemek için standartlaştırılmış protokoller ve araçlar geliştirmek, sadece benzersiz biyolojilerini daha iyi anlamamıza yardımcı olmakla kalmayacak, aynı zamanda ilaç dağıtımı da dahil olmak üzere yeni terapötik stratejiler için yararlanabilecek içgörü sağlayacaktır²⁰. Bu yöntem el yazması, makropinozomların luminal biyokimyasının çeşitli yönlerini tek organel düzeyde parçalamak için yakın zamanda geliştirilen araçlara odaklanacaktır.

Floroforlar, i) tercihen ilgi alanına bölünürlerse ve/veya ii) ilgi parametresine yanıt olarak spektral değişikliklere uğrarlarsa organellerin spesifik biyokimyalarını ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, pH durumunda, acridine portakal, cresyl violet ve LysoTracker boyaları gibi floresan zayıf bazlar tercihen asidik organellerde birikir. Bu nedenle, göreceli yoğunlukları etiketli organellerin asidik olduğunun kaba bir göstergesidir. Floresan, pHrodo ve cypHer5e gibi diğer pH duyarlı floroforlar protonlara bağlanınca spektral değişikliklere uğrar (Şekil 1A–C). Bu nedenle pH’a duyarlı floroforların floresan emisyonundaki değişiklikler pH’ın yararlı bir yaklaşık örneğini sağlayabilir. Bununla birlikte, tek floroforların kullanımı bir dizi dezavantaj sunar. Örneğin, odak düzleminde yapılan değişiklikler, fotobleaching ve makropinozomlarda yaygın bir olay olan tek organellerin hacmindeki değişiklikler²¹, tek floroforların floresan yoğunluğunda değişikliklere neden olabilir ve bu²²için kolayca düzeltilemez. Tek dalga boyu değerlendirmeleri, asidik bölmeleri görselleştirmek için yararlı olsa da, bu nedenle tamamen niteldir.

Daha nicel bir yaklaşım, parametreye duyarlı floroforu ve ilgi organeline bir referans floroforu hedeflemektir. Referans florofor, organel içindeki biyokimyasal değişikliklere karşı ideal olarak duyarsızdır (Şekil 1D–F) ve bu nedenle odak düzleminde, organeller hacimde ve bir dereceye kadar fotobleaching²³‘teki değişiklikleri düzeltmek için kullanılabilir. Çift florofor ratiometrik floresan olarak adlandırılan bu yaklaşım kullanılarak, parametreye duyarlı floroforun floresan emisyonunun referans florofora oranı oluşturularak düzeltme sağlanabilir.

Burada protokol, makropinozomlarda pH, oksidatif olaylar ve protein bozulmasını ölçmek için çift florofor oranımetrik görüntüleme prensibini kullanacaktır. Her durumda, ilgi parametresine duyarlı bir florofor ve bir referans florofor seçilecektir. Floroforları özellikle makropinozomlara hedeflemek için, tercihen makropinoomlara dahil edilen 70 kDa dektran ile eşçekimli olarak birleştirilecektir²⁴. Tüm tahliller Raw264.7 hücrelerinde yapılacaktır ancak diğer hücre tiplerine uyarlanabilir. Mümkün olduğunda, floresan oranları mutlak değerler kazanmak için bir referans eğriye göre kalibre edilecektir. Daha da önemlisi, makropinozomların ışıklı ortamının dinamik ve nicel değerlendirilmesi için tüm ölçümler canlı hücrelerde yapılacaktır.

pH’a duyarlı floroforlar seçilirken, bir dizi dikkat edilmesi gereken husus tartılmalıdır. Birincisi, probun en hassas olacağı pH değerleri aralığını gösteren floroforun pK a’dır. Oluşumdan kısa bir süre sonra, makropinozomun pH’ının hücre dışı ortamınkine (~pH 7.2) yakın olacağı ve geç endozomlar ve lizozomlarla (~pH 5.0) etkileşimler yoluyla aşamalı olarak asitleşeceği varsayılırsa, bu aralıkta hassas olan pK a içeren_bir prob seçilmelidir (Şekil 2C). pK’ı 6.4 olan florofor floresan, bu aralıkta en hassas olanıdır. Fagozomlar gibi diğer benzer organelleri ölçmek için yaygın olarak kullanılmıştır ve bu yazıda tercih edilen florofor olacaktır^22,25. Referans florofor olarak, pH’a duyarsız olan tetrametilrhodamin kullanılacaktır (Şekil 1E). pHrodo ve cypHer5e gibi diğer floresanlar, floresanın spektral özelliklerinin diğer deneysel değişkenlerle eşleştiği floresan yerine geçebilir. pHrodo ve cypHer5e için önerilen bazı referans floroforları Şekil 1‘de gösterilmiştir.

İkinci bir husus, iki floroforun özellikle makropinozomlara hedeflenecekleri yöntemdir. Kabaca 7 nm hidrodinamik yarıçapı olan 70 kDa büyüklüğündeki dektran, hücrelere özel olmayan yapışmaz ve makropinoomlara dahil edilir, ancak clathrin kaplı çukurlara veya caveolae’ye dahil değildir ve bu nedenle makropinozomları işaretler (Şekil 2A ve Şekil 3A,B)^16,24,26. Bu protokolde pH’a duyarlı ve referans problar olarak sırasıyla floresan etiketli 70 kDa dektran ve tetrametrinhodamin (TMR) etiketli 70 kDa dektran kullanılacaktır.

Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde, makropinositoz ve fagositoz, adaptif immün yanıtın hücrelerine işlenmek ve daha sonra sunul için eksojen materyalin içselleştirilmesi için iki ana yolu temsil eder²⁷. Fagozomların ve makropinozomların lümeninin redoks kimyasının dikkatli ve koordineli kontrolü, eksojen malzemenin bağlama özgü işlenmesi için kritik öneme sahiptir. Fagozomlarda oksidatif olayların belki de en iyi çalışılmış düzenleyicisi, fagozomların lümeninde büyük miktarlarda reaktif oksijen türleri (ROS) üreten büyük bir çok alt ünez kompleksi olan NADPH^{oksidazdır 28}. Gerçekten de, aktivitesi fagozomlar içinde uygun antijen işleme merkezidir^29,30. Yine de, NADPH oksidazının makropinosomal zarlar üzerindeki aktivitesi araştırılmamıştır.

Bu protokolde, H2DCFDA süksinimsal ester makropinozom içindeki oksidatif olayları ölçmek için kullanılır. Bu, azaltılmış formunda minimal floresan olan modifiye bir floresan formudur (2′,7′-diklorodihydrofluorescein diasetat). Oksidasyon üzerine floresan emisyonu önemli ölçüde artar. Bununla birlikte, H2DCFDA’nın önemli bir uyarısını belirtmek gerekir – florofor floresanlara dayandığı için, floresan asidik bölmelerde de söndürülür ve deneyler tasarlarken bu değişkenin kontrolüne özen edilmelidir²⁸. pH ölçümü yaklaşımına benzer şekilde, H2DCFDA süksinidil ester kovalent olarak 70 kDa dektrana bağlanacak ve referans florofor olarak TMR etiketli 70 kDa dektran kullanılacaktır (Şekil 3A).

Floresan ovalbumin makropinozomlar içindeki protein bozulmasını ölçmek için kullanılacaktır. Burada kullanılan ovalbumin yoğun bir şekilde kendiliğinden söndürülen 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL boyası ile etiketlenmiştir. Sindirim üzerine, güçlü floresan boya etiketli peptitler serbest kalır. Ovalbumin kolayca 70 kDa dektran’a konjuge edilemediği için, TMR etiketli 70 kDa dektran ve sıvı fazlı ovalbumin içeren hücreler birlikte inkübe edilecektir. TMR sinyali, görüntüleme sonrası analiz sırasında makropinozom maskesi oluşturmak için kullanılacak ve sindirilen ovalbuminden kurtarılan sinyal maske içinde ölçülecektir (Şekil 3B).