概要

Создание электрофизиологической платформы для моделирования БАС с регионально-специфическими человеческими плюрипотентными астроцитами и нейронами, полученными из стволовых клеток

Published: August 26, 2021
doi:

概要

Описан метод дифференциации индуцированных человеком плюрипотентных астроцитов и нейронов спинного мозга и их кокультуры для электрофизиологической записи.

Abstract

Человеческие плюрипотентные астроциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-A) и нейроны (hiPSC-N), обеспечивают мощный инструмент для моделирования патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro. Записи многоэлектродной решетки (MEA) являются средством регистрации потенциалов электрического поля от больших популяций нейронов и анализа сетевой активности с течением времени. Ранее было продемонстрировано, что наличие hiPSC-A, которые дифференцируются с использованием методов продвижения фенотипа астроцитов спинного мозга, улучшает созревание и электрофизиологическую активность регионально специфических hiPSC-моторных нейронов спинного мозга (MN) по сравнению с теми, которые культивируются без hiPSC-A или в присутствии астроцитов грызунов. Здесь описан метод совместного культивирования спинного мозга hiPSC-A с hiPSC-MN и регистрации электрофизиологической активности с использованием записей MEA. В то время как протоколы дифференцировки, описанные здесь, характерны для астроцитов и нейронов, которые регионально специфичны для спинного мозга, платформа кокультурирования может быть применена к астроцитам и нейронам, дифференцированным с помощью методов, специфичных для других судеб, включая корковый hiPSC-A и hiPSC-N. Эти протоколы направлены на предоставление электрофизиологического анализа для информирования о взаимодействиях глиа-нейронов и обеспечения платформы для тестирования лекарств с терапевтическим потенциалом при БАС.

Introduction

Человеческие плюрипотентные астроциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-A) и нейроны (hiPSC-N), являются мощными инструментами для моделирования патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro и обеспечивают трансляционную парадигму для стратегий открытия лекарств1. Исследователи продемонстрировали, что кокультура hiPSC-A с hiPSC-N усиливает морфологическое, молекулярное, электрофизиологическое и фармакологическое созревание обоих типов клеток, генерируя сложные нейронные сети и взаимодействия астроцитов и нейронов, которые напоминают их аналоги in vivo 2,3. Подобные эксперименты с кокультурой могут повторить признаки патобиологии БАС, такие как астроцитарно-опосредованная нейротоксичность 4,5 и нейрональная гипервозбудимость6. Кроме того, благодаря достижениям в протоколах дифференцировки, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) могут быть дифференцированы в регионально-специфические нервные подтипы, включая кортикальный и спинной мозг hiPSC-A и hiPSC-N 7,8. Эти стратегии обеспечивают потенциал для моделирования патологии кортикальных и спинальных двигательных нейронов при БАС, а также астроцитарного влияния на оба. Однако для этого требуется воспроизводимый функциональный анализ для определения этих эффектов.

Недавно было показано, что запись многоэлектродной решетки (МЭА) особенно подходит для электрофизиологической характеристики нейрон-астроцитарных кокультур2. В отличие от одноклеточных электрофизиологических анализов, эти электродные массивы высокой плотности пассивно регистрируют потенциалы внеклеточного поля от больших популяций нейронов, не нарушая условия культивирования и сохраняя целостность клеточных мембран. Эти платформы особенно полезны для записи клеточной и сетевой активности культур с течением времени и в ответ на фармакологические манипуляции. Наконец, когда присутствие астроцитов является переменной культуры, записи MEA могут обеспечить функциональное понимание двунаправленных взаимодействий астроцитов и нейронов 2,9.

Здесь представлен оптимизированный протокол для дифференциации hiPSC в hiPSC-A спинного мозга и hiPSC-моторные нейроны (MN), который был ранее проверен2. Протокол дифференцировки hiPSC-A спинного мозга последовательно приводит к культурам астроцитов, которые являются положительными для S100 кальций-связывающего белка B (S100β), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и гомеобокса B4 (HOXB4) в 80%, 50% и 90% клеток соответственно, что указывает на созревание глиального и спинного мозга 2,10 . Протокол дифференцировки hiPSC-MN генерирует нейроны, которые >90% положительны для холина ацетилтрансферазы (ChAT), что наводит на мысль о зрелой идентичности альфа-моторных нейронов2. Кроме того, протокол описывает методы генерации кокультур hiPSC-A/MN, которые, как было ранее продемонстрировано, приводят к появлению нейронов с повышенной морфологической сложностью с помощью анализа Шолля и иммунофлуоресцентной микроскопии по сравнению с нейронными культурами без астроцитов или с астроцитами грызунов2. Хотя эти описания специфичны для спинного мозга hiPSC-A и hiPSC-N, уникальное преимущество заключается в том, что первоначальная независимая культура астроцитов и нейронов, за которой следуют шаги по совместной культивированию в более поздние моменты времени, может быть переведена для изучения эффектов взаимодействия нейронов-астроцитов из других конкретных областей, а также специфических для заболевания клеток 7,8 . Наконец, протокол описывает, как выращивать эти культуры на пластинах MEA, чтобы функциональная активность как фактор состава кокультуры могла быть изучена с течением времени с возможностью манипулировать клеточным составом, а также условиями культуры.

Целью этих протоколов является предоставление функционального анализа для исследования взаимодействий астроцитов и нейронов, изучения специфических для заболевания изменений и тестирования лекарств с терапевтическим потенциалом в области БАС. Видеоинструкции приведены для наиболее сложных шагов этого протокола.

Protocol

1. Подготовка среды для клеточных культур Подготавливают отдельные клеточные питательные среды, используя композиции, указанные в таблице 1. Смешайте и стерильно фильтруйте среду в бутылках с фильтром по 500 мл и храните защищенными от света при 4 °C в течение 2 недель.</…

Representative Results

Протокол формирования паттернов спинного мозга для генерации hiPSC-MN и hiPSC-A спинного мозга описан на рисунке 1. В этом протоколе hiPSCs поддерживаются и проходят как несмешивающиеся колонии (рисунок 2A). Нейрогенез инициируется (нейронная индукция) путем двойн?…

Discussion

На сегодняшний день методы электрофизиологических записей кокультур астроцитарных нейронов на основе hiPSC и MEA нашли ограниченное применение в области ALS6 и до сих пор не полностью человеческие платформы, в отличие от их более широкого использования для моделирования эпи…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта рукопись была поддержана следующим: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Премия за развитие карьеры клинического ученого Благотворительного фонда Дорис Дьюк (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Мы благодарим д-ра Раху Дастгейба и д-ра Нормана Хоги за предоставление платформы MEA и программного обеспечения для анализа данных, которое мы использовали для проверки описанной электрофизиологической платформы. Мы хотели бы поблагодарить Халила Руста за помощь в демонстрации протокола и съемках.

Materials

10 cm sterile culture plates Falcon 353003
25 cm2 sterile culture flasks Falcon 353136
2-Mercaptoethanol (β-ME) Thermofisher 21985023 Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System Corning 430769
5 mL pipette Falcon 357543
6 well sterile culture plates Falcon 3046
Amphotericine B Gibco 15290018 Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme Sigma-Aldrich Z273287 Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC) Sigma A4403 Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) Axion OPT-24
Axion Edge MEA platform Axion Maestro Edge
Basement Membrane matrix – Matrigel Corning 354277 Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) Zeiss 415510-1100-000 Primo Vert
Bicuculline Sigma Aldrich 14340 Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13 Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge AirGas/Harris 9296NC
Compound E Abcam ab142164 Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX) Sigma Aldrich C239 Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK) Tocris 111 Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12 Thermofisher 113300 Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement Thermofisher A1517001 Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermofisher 16140071 Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) Peprotech 450-10 Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer Election Microscopy Sciences 63510-20
Heparin Millipore-sigma H3149-100KU Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator ThermoFisher 370 set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) R&D systems 291-G1-200 Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid Abcam ab144490 Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10828 Working concentration 1x
Laminin Thermofisher 23017-015 Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189 Stemgent 04-0074 Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine Thermofisher 25030 Working concentration 100x
MEA glass plates MultiChannel Systems 60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200 Gilson PJ22224
Neurobasal Thermofisher 21103049 Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermofisher 11140050 Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin Thermofisher 15140122 Working concentration 100x
Polyornithine (PLO) Sigma-Aldrich P3655 Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl) NA NA Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN) Millipore-Sigma 540223 Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor Peprotech 1293823 Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542 Sigma S4317 Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods Baker Company SG-600
Supplement B – B27 Supplement Thermofisher 21985023 Working concentration 50x
Supplement N – N2 Supplement Thermofisher 17502048 Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge ThermoFisher 75004261 Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film – Parafilm PARAFILM P7793
Tissue dissociation protease – Dispase StemCell Technologies 7923 Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermofisher 2530054 Working concentration 1x
Waterbath ThermoFisher 2332 Isotemp

参考文献

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Play Video

記事を引用
Taga, A., Habela, C. W., Johns, A., Liu, S., O’Brien, M., Maragakis, N. J. Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (174), e62726, doi:10.3791/62726 (2021).

View Video