Nucleaire migratie in de Drosophila Oocyte

Sinds enkele jaren is de Drosophila-oöcyt een modelsysteem om nucleaire migratie te bestuderen. De Drosophila oöcyt ontwikkelt zich in een meercellige structuur genaamd de eikamer. Eikamers omvatten 16 kiemcellen (15 verpleegstercellen en de oöcyt) omgeven door een epitheellaag van folliculaire somatische cellen. De ontwikkeling van de eikamer is onderverdeeld in 14 stadia(figuur 1A),waarin de oöcyt zal groeien en reserves zal opbouwen die nodig zijn voor de vroege ontwikkeling van het embryo. Tijdens de ontwikkeling, bij microtubulireorganisatie en asymmetrisch transport van maternale determinanten, polariseert de oöcyt langs de antero-dorsale en dorso-ventrale assen. Deze assen bepalen de daaropvolgende polariteitsassen van het embryo en de volwassene die voortvloeien uit de bevruchting van deze oöcyt¹. Tijdens oogenese neemt de kern een asymmetrische positie in de oöcyt in. In fase 6 is de kern gecentreerd in de cel. Bij een nog te identificeren signaal dat wordt uitgezonden door de achterste folliculaire cellen dat door de oöcyt wordt ontvangen, migreert de kern naar het snijpunt tussen de voorste en laterale plasmamembranen in fase 7 (Figuur 1B)^2,3. Deze asymmetrische positie is nodig om de bepaling van de dorso-ventrale as te induceren.

Figuur 1: Drosophila melanogaster eierkamers. (A) Vaste ovariole van transgene vliegen die Fs(2)Ket-GFP uitdrukken die de nucleaire enveloppen en ubi-PH-RFP labelt die de plasmamembranen etiketteert. De ovariole bestaat uit het ontwikkelen van eierkamers in verschillende stadia. De rijping neemt toe langs de antero-posterieure as met het germarium aan de voorste punt (links) waar de kiemstamcel zich bevindt en het oudere stadium aan de achterste punt (rechts). (B) Z-projectie van levende eierkamer door het spinnen van schijf confocale microscopie in stadium 6 van oogenese (links), waarin de kern is gecentreerd in de oöcyt. De kern migreert om een asymmetrische positie in te nemen in stadium 7 (rechts) in contact met het voorste plasmamembraan (tussen de oöcyt en de verpleegkundige cel) en het laterale plasmamembraan (tussen de oöcyt en de folliculaire cellen). Deze positie zal de bepaling van de dorsale kant en dus de dorso-ventrale as van de eierkamer induceren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Al vele decennia wordt deze nucleaire migratie bestudeerd op vaste weefsels door immunostaining. Deze aanpak heeft met name aangetoond dat dit proces afhankelijk is van een dicht netwerk van microtubuli^4,5. Meer recent hebben we een protocol ontwikkeld met voorwaarden die compatibel zijn met live beeldvorming van de oöcyt gedurende enkele uren, waardoor het mogelijk is om dit proces dynamisch te bestuderen⁶.

Daarom hebben we voor het eerst kunnen beschrijven dat de kern tijdens zijn migratie voorkeurs- en karakteristieke trajecten heeft, een langs het voorste plasmamembraan (APM) en een andere langs het laterale plasmamembraan (LPM) van de oöcyt (figuur 2). Deze laatste resultaten onderstrepen het belang van live-imaging protocollen bij het bestuderen van dynamische processen zoals nucleaire migratie.

Figuur 2: Schematische weergave van de verschillende migratiepaden van de kern. In stadium 6 van de oogenese is de oöcyt een grote cel met een centrale kern. In dit stadium wordt de antero-posterieure polariteitsas ingesteld met een posterieure/laterale plasmamembraan van de oöcyt in contact met de folliculaire cellen en het voorste plasmamembraan (in geel) staat in contact met de verpleegkundige cellen². We hebben eerder gemeld dat de kern kan migreren langs het voorste plasmamembraan (APM), langs het laterale plasmamembraan (LPM), of via het cytoplasma (STAD, rechtstreeks naar de antero-dorsale cortex)⁶. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De oöcytkernmigratie is een fenomeen van ongeveer 3 h⁶, en tot nu toe is de gebeurtenis die het begin van de daadwerkelijke migratie veroorzaakt onbekend. Het begin van de migratie kan ook worden vertraagd door eiwitmutanten die worden gebruikt om dit mechanisme te bestuderen. Deze onbekende variabelen motiveerden ons om beelden te verwerven over lange periodes (10-12 uur). Het is daarom belangrijk om ervoor te zorgen dat de oöcyten in leven blijven. Naarmate de eierkamer zich ontwikkelt, verlengt deze langs de voorste-posterieure as van een bolvormige naar een elliptische vorm. Deze rek wordt aangedreven door de rotatie van folliculaire cellen, die plaatsvindt van stadium 1 tot stadium 8, loodrecht op de voorste-posterieure as⁷. Bovendien omringt een buisvormige spierschede met pulsatile eigenschap de eierkamers. Zijn fysiologische functie is om de ontwikkelende follikels naar de eileider onophoudelijk te duwen⁸. Om de bewegingen te beperken die na hun dissectie oscillaties van de eierkamers veroorzaken, hebben we een observatiemicrokamer ontworpen van 150 μm hoog (figuur 3A). Deze hoogte is marginaal hoger dan de grootte van een follikel in fase 10 en 11. Het beperkt de verticale bewegingen van het monster aanzienlijk met behoud van de rotatie van de eikamer, wat resulteert in beperkte defecten in de follikelontwikkeling. Vervolgens voeren we gedurende 12 uur live beeldvorming uit op ontleedde eierkamers door time-lapse-acquisities met meerdere standen met behulp van een confocale microscoop met spinschijf. Hier beschrijven we ons protocol voor het bestuderen van de oöcyt nucleaire migratie tussen fase 6 en 7.

Figuur 3: Schematische weergave van de observatiekamer. (A) (Bovenaanzicht) Precieze afmetingen van de aluminium glijbaan met de hoogten (A’) en omtrek (A”) van de put die in het midden van de glijbaan is geboord. (B) (Onderste weergave) Een afdeklip die de put blokkeert, wordt met siliciumvet op de glijbaan afgedicht. (C) (Bovenaanzicht) Ontlede ovarioles ontwikkelen zich in een beeldvormingsmedium dat wordt bedekt door een gasdoorlatend membraan. Halocarbon olie wordt gebruikt om het membraan te stabiliseren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om de nucleaire migratie te volgen en trajecten in de oöcyt nauwkeurig te beoordelen, zijn markers nodig voor zowel de nucleaire envelop als het plasmamembraan. Met dit doel zijn twee transgenen geselecteerd die een hoge signaal/ruisverhouding hebben en niet vervagen in de loop van live beeldvorming. Om het plasmamembraan te labelen, wordt het gebruik van een P[ubi-PH-RFP] dat codeert voor het Pleckstrin Homology (PH) domein van de Human Phospholipase C ∂1 (PLC∂1) gefuseerd met RFP aanbevolen. Dit PH-domein bindt aan het phosphoinositide PI(4,5)P2 verdeeld over het plasmamembraan van de oöcyt⁹. Voor de nucleaire enveloppe geeft de P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP eiwitvalstam waarbij GFP wordt ingevoegd in het gen dat codeert voor de Drosophila ß-importine een homogeen en intens signaal^{weer 10}. Jonge vliegen (1-2 dagen oud) worden 24-48 uur voor eierstokdissectie in verse flesjes met droge gist geplaatst.

Voor deze live-imaging test is een 1 mm dik stuk aluminium, dat niet reactief is voor het monster, in de afmetingen van een microscopieschuif gesneden. Het heeft een gat met een diameter van 16 mm in het midden van de glijbaan dat is tegengeplaatst tot 0,85 mm. Deze counterbore heeft een extra gat met een diameter van 6 mm met een diepte van 150 μm (figuur 3A). Aan de onderkant van de aluminiumkamer wordt een afdeklip gelijmd met siliconenvet (inert voor het monster) (afbeelding 3B). Na het plaatsen van de monsters in de medium gevulde put wordt een membraan doorlaatbaar tot O₂/CO_{2-uitwisseling} over het medium geplaatst en omgeven door halokoolstofolie (figuur 3C).

Voor de dissectie wordt aanbevolen om roestvrijstalen tangen met een tipmaat van 0,05 x 0,02 mm en naalden met een diameter van 0,20 mm te gebruiken voor de scheiding van de ovarioles(figuur 4B, C). De migrerende kernen worden afgebeeld op een spin-schijf confocale omgekeerde microscoop CSU-X1 uitgerust met een camera. Multi-position beelden werden verkregen door time-lapse elke 15 minuten bij 24 °C. Een interval van 15 minuten maakt het mogelijk om multipositie-acquisities uit te voeren met beperkte fotobleaching van de fluorescerende eiwitten en fototoxiciteit voor de monsters. Bovendien zou een korter interval niet veel meer informatieve gegevens opleveren om de nucleaire trajecten te volgen. De films worden verwerkt en geanalyseerd via Fiji software¹¹.