Rapid <em>In Vivo</em> Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Yoshika Janapala; Katrina Woodward; Jiwon Lee; Melanie Rug; Thomas Preiss; Nikolay E. Shirokikh

doi:10.3791/62639

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生物学

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Published: December 25, 2021

doi:

10.3791/62639

Yoshika Janapala*¹, Katrina Woodward*¹, Jiwon Lee², Melanie Rug², Thomas Preiss^1,3, Nikolay E. Shirokikh¹

¹Division of Genome Sciences and Cancer, The John Curtin School of Medical Research,The Australian National University, ²Centre for Advanced Microscopy,The Australian National University, ³Victor Chang Cardiac Research Institute

概要

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Abstract

Las respuestas rápidas que implican una rápida redistribución del ARN mensajero (m) y alteraciones de la traducción del ARNm son pertinentes para los ajustes homeostáticos en curso de las células. Estos ajustes son críticos para la supervivencia de las células eucariotas y el “control de daños” durante los niveles fluctuantes de nutrientes y salinidad, la temperatura y diversas tensiones químicas y de radiación. Debido a la naturaleza altamente dinámica de las respuestas a nivel de ARN y la inestabilidad de muchos de los intermedios ARN:ARN y ARN:proteína, la obtención de una instantánea significativa del estado del ARN citoplasmático solo es posible con un número limitado de métodos. Los experimentos de perfil de ribosoma basados en ARN-seq en todo el transcriptoma se encuentran entre las fuentes de datos más informativas para el control de la traducción. Sin embargo, la ausencia de una estabilización intermedia uniforme de ARN y ARN:proteína puede conducir a diferentes sesgos, particularmente en las vías de respuesta celular de ritmo rápido. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado de fijación rápida aplicable a las células eucariotas de diferente permeabilidad, para ayudar en la estabilización intermedia de ARN y ARN: proteína. Además, proporcionamos ejemplos de aislamiento de los complejos estabilizados de ARN:proteína en función de su co-sedimentación con fracciones ribosómicas y poli(ribo)somales. El material estabilizado separado se puede utilizar posteriormente como parte de experimentos de tipo perfilado de ribosomas, como en el enfoque de secuenciación de perfiles complejos de traducción (TCP-seq) y sus derivados. La versatilidad de los métodos de estilo TCP-seq ahora ha sido demostrada por las aplicaciones en una variedad de organismos y tipos de células. Los complejos estabilizados también pueden ser purificados por afinidad y fotografiados utilizando microscopía electrónica, separados en diferentes fracciones poli(ribo)somales y sometidos a secuenciación de ARN, debido a la facilidad de la inversión de reticulación. Por lo tanto, los métodos basados en el enfriamiento por instantáneas y la fijación de formaldehído, seguidos por el enriquecimiento del complejo ARN:proteína basado en sedimentación u otro tipo, pueden ser de particular interés en la investigación de detalles más finos de la dinámica rápida del complejo ARN:proteína en células vivas.

Introduction

Los organismos vivos están sujetos a cambios dinámicos intra y extracelulares a lo largo de su vida útil, que requieren respuestas rápidas para mantener la homeostasis y garantizar la supervivencia. Para permitir la adaptación ambiental, las células eucariotas ajustan su metabolismo a través del control de la expresión génica. El control de la expresión génica puede ejercerse durante la transcripción y/o traducción; con respuestas traslacionales que generalmente ocurren más rápidamente¹^,²^,³^,⁴. Por ejemplo, los cambios traslacionales generalmente surgen dentro de 1-30 minutos del inicio del estrés, mientras que las alteraciones a nivel de transcripción siguen horas después de la exposición al estrés^3,⁴^,⁵. Las alteraciones en la salida de la traducción se logran más rápidamente debido a la disponibilidad persistente de moléculas de ARN mensajero (m) en el citoplasma. Por el contrario, a nivel de transcripción, se deben sintetizar nuevas moléculas de ARNm, y en eucariotas, procesadas y exportadas desde el núcleo, produciendo grandes retrasos en el tiempo de respuesta^2,^4,^6,^7,^8.

La respuesta traslacional aguda al estrés se caracteriza generalmente por una disminución general en la producción de traducción, con la regulación ascendente selectiva de las proteínas necesarias para la supervivencia celular.¹^,³^,⁴^,⁹. Se cree que la disminución de la producción de proteínas es crucial debido al alto gasto de energía del proceso.³^,⁷. Para facilitar la inhibición selectiva y la regulación ascendente, las respuestas traslacionales son atendidas por una serie de mecanismos reguladores complejos. La regulación puede ejercerse en todas las fases de la traducción: iniciación, elongación, terminación de la biosíntesis de polipéptidos y reciclaje ribosómico¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³, pero se exhibe con mayor fuerza en la fase de iniciación⁵^,⁷^,⁹^,¹⁰^,¹³. Durante el inicio, la pequeña subunidad ribosómica (SSU), asistida por factores de iniciación eucariota (eIF), se une y escanea la región no traducida (UTR) de 5′ de ARNm hasta que se reconoce un codón de inicio.²^,⁵^,⁶^,⁸^,¹¹^,¹²^,¹³. Los mecanismos regulatorios a menudo se dirigen a los eIF que afectan la fijación, el escaneo y el reconocimiento de codones de inicio. Por ejemplo, el factor de iniciación eIF2, un factor de traducción esencial que ayuda en el reclutamiento de un iniciador Met-tRNA_i^Met a la SSU, a menudo se dirige a eucariotas en condiciones de estrés⁴^,⁶^,¹¹. En la levadura, la fosforilación de este factor puede ser inducida bajo privación de nutrientes y estrés osmótico.¹^,⁴^,¹¹^,¹⁴^,¹⁵, y en las células de mamíferos, la inanición de aminoácidos, el estrés del retículo endoplásmico (RE), el estrés UV, la infección viral y los niveles alterados de oxígeno pueden desencadenar esta respuesta⁸^,⁹^,¹¹. La rápida regulación ascendente de la traducción específica de ARNm es evidente en la respuesta de las células de mamíferos a la hipoxia, que exhibe una inhibición de la traducción rápida global y una regulación ascendente selectiva de la biosíntesis de factores inducibles por hipoxia (HID). Los HIF son factores de transcripción, que luego provocan una reprogramación celular a largo plazo a nivel de transcripción de ADN.⁸^,⁹^,¹⁶. Se han observado respuestas similares en levaduras bajo estrés por calor, con una rápida expresión traslacional de las proteínas de choque térmico (HSP) seguida de respuestas retardadas a nivel de transcripción¹⁷^,¹⁸. Además de la privación de nutrientes y el choque térmico, las respuestas traslacionales en la levadura se han estudiado bajo oxígeno variable.⁸^,¹⁹salinidad⁵, fosfato, azufre²⁰^,²¹ y nitrógeno²²^,²³ Niveles. Esta investigación tiene implicaciones generalizadas para los usos industriales de la levadura, como la cocción y la fermentación.²⁴^,²⁵. Las respuestas traslacionales también pueden ser fundamentales para promover la comprensión de enfermedades como los trastornos neurodegenerativos y las enfermedades cardíacas, que se caracterizan por tensiones intracelulares como el estrés oxidativo. En general, las respuestas traslacionales son parte integral del control de la expresión génica y facilitan la adaptación rápida a una amplia gama de condiciones de estrés en organismos eucariotas.

Para estudiar las respuestas traslacionales, se requieren métodos que proporcionen instantáneas mínimamente distorsionadas del panorama de la traducción. El perfil de polisomas es un enfoque clásico utilizado en el estudio de la traducción a través del ARNm, que implica la separación de fracciones poli(ribo)somales de ARNm mediante ultracentrifugación a través de gradientes de sacarosa²⁶^,²⁷. El enfoque puede utilizarse para explorar los niveles de traducción de los ARNm individuales (con los métodos de detección como la transcripción inversa y la reacción en cadena de la polimerasa, RT-PCR^26),o globalmente en conjunción con técnicas de alto rendimiento (microarray o RNA-seq²⁸^,²⁹). Un enfoque más evolucionado es el perfil de ribosomas, que permite el estudio de las posiciones de los ribosomas alargados a lo largo de una molécula de ARNm a escala de todo el genoma, así como la inferencia de la eficiencia de la traducción a través del transcriptoma y la utilización de los sitios de inicio principales y alternativos³⁰^,³¹. El perfil de ribosomas implica el aislamiento y la secuenciación de fragmentos de ARNm protegidos por la presencia ribosómica sobre ellos. El perfil de ribosomas ha proporcionado una visión considerable de la dinámica de la traducción en una serie de afecciones, incluido el estrés hipóxico, el choque térmico y el estrés oxidativo³¹^,³². La técnica se ha adaptado a múltiples tipos de materiales de origen, incluyendo levaduras y células de mamíferos.

Si bien el perfil de polisomas y ribosomas ha sido fundamental para ampliar las capacidades de investigación en traducción, el proceso de traducción incluye varios intermedios y complejos traslacionales que son difíciles de capturar con estos métodos¹¹^,¹³. Una limitación adicional se deriva de la falta de capacidad para estudiar tipos de respuesta rápida, ya que los complejos traslacionales se estabilizan in vivo mediante la adición de inhibidores de traducción específicos (antibióticos), lo que lleva a ciertos artefactos de distribución de ribosomas, o ex vivo en la lisis celular específicamente (antibióticos) o inespecíficamente (iones altos en sal o magnesio), lo que lleva a la privación de los intermedios de vida más corta o menos estables³³^, ³⁴^,³⁵.

El formaldehído se usa ampliamente para reticular ácidos nucleicos y proteínas, como en los estudios de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) e inmunoprecipitación de reticulación (CLIP). Su pequeño tamaño y excelente permeabilidad celular permiten una rápida acción in vivo ³⁶. Basado en la rápida reticulación de formaldehído, el enfoque de perfilación de ribosomas se ha ampliado con la Secuenciación de Perfiles Complejos de Traducción (TCP-seq)¹⁰^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰. TCP-seq, desarrollado por primera vez en levaduras, permite la captura de todos los intermedios de traducción, incluidos los complejos SSU de escaneo o post-terminación y las múltiples configuraciones ribosómicas³⁷^,³⁸^,⁴¹^,⁴². El método se ha utilizado en varios estudios^10,^38,^39,^41,^42,algunos de los cuales utilizan un enfoque combinatorio tanto de inhibidores de la traducción como de reticulación de formaldehído para facilitar la detención de la traducción. Una versión modificada adicional de la técnica, TCP-seq³⁹selectivo, se ha empleado recientemente para incluir la inmunopurificación de los complejos reticulados, ampliando el alcance de las aplicaciones TCP-seq. La naturaleza rápida, eficiente y reversible de la reticulación de formaldehído hace que estos enfoques sean adecuados para estudiar interacciones complejas transitorias de ARNm:traducción, particularmente en el contexto de vías de respuesta a nivel de traducción altamente dinámicas.

Aquí detallamos los procesos de reticulación de formaldehído in vivo con el propósito de la estabilización y aislamiento complejo de traducción integral. Proporcionamos protocolos separados matizados para levaduras y células de mamíferos(Figura 1). Además, describimos ejemplos del uso posterior del material estabilizado por reticulación(Figura 1),como para la detección del factor de proteína copurificado mediante inmunoblotting (western-blotting), purificación inmunoasistida (o “inmunoprecipitación”; IP) y enriquecimiento de complejos traslacionales que contienen factores específicos de interés, microscopía electrónica y secuenciación de ARN.

Figura 1: Esquema que representa una visión general de la configuración experimental típica. Los pasos principales de la estabilización de formaldehído in vivo de complejos traslacionales se representan como un diagrama de flujo, complementado con información sobre los instrumentos clave necesarios. Se describen las posibles aplicaciones posteriores del material reticulado, incluidos ejemplos que se han empleado con éxito pero que no se cubren directamente en este protocolo, como la purificación de cuentas SPRI del ARN, la secuenciación del ARN y la espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Protocolo de células de levadura Cultivo y fijación de células de levaduraNOTA: La fijación celular y la cosecha se adaptan de10,38con modificaciones. Establecer un cultivo celular de levadura de 1 L (tipo salvaje (WT) BY4741 se dan como ejemplo) en un agitador orbital con la densidad óptica inicial de no más de 0,05 UA a 600 nm (OD600)en medios adecuados (1% p/v de extracto de levadura, 2% p/v de peptona, 2% p/v de dextrosa (glucosa), 40 mg/L de sulfato de adenina (YPD) utilizado como ejemplo) en las condiciones deseadas (30 °C utilizado en este experimento). Configure una centrífuga preparativa con botellas de rotor y centrífuga compatibles para peletizar el cultivo en suspensión líquida de células de levadura. Para los experimentos de inanición de glucosa, gletear las células una vez que se alcanza la densidad óptica de 0.6-0.8 UA a 600 nm (OD600),utilizando una breve centrifugación a 30 ° C, 5,000 x g durante 1 min.NOTA: Mantenga un registro de la OD de las células en crecimiento y deje que las células crezcan hasta que la OD600 alcance 0.6-0.8 UA, si la fase de crecimiento exponencial es de interés. Resuspender el pellet inmediatamente en medios YP calientes (30 °C) que contengan glucosa añadida nula o baja (0,25% p/v) e incubar el cultivo durante otros 10 min a 30 °C en un agitador-incubadora orbital.NOTA: La composición de los medios puede afectar a la eficiencia de la reticulación posterior. Este protocolo se probó utilizando YPD solamente. Al realizar experimentos de inanición, es fundamental cumplir con el tiempo y minimizar los retrasos entre los procedimientos. Una vez que las celdas estén listas, coloque una caja de hielo dentro de la campana de humos con un vaso de precipitados que contenga 250 g de hielo de agua triturada limpia. Asegúrese de que las stripettes de 25 ml y la solución de formaldehído estabilizado con metanol al 37% p/v recién comprada estén accesibles dentro de la campana. Vierta el cultivo de 1 L en el vaso de precipitados que contiene 25% p/v de hielo de agua triturada.NOTA: Mantenga las celdas en hielo durante todas las operaciones posteriores hasta que las celdas se congelen, a menos que se indique lo contrario. Agregue 75 ml de 37% p/v de solución de formaldehído a una concentración final de 2.2% p/v y revuelva intensamente la mezcla hasta que el hielo se derrita. Una vez que el hielo se derrita, configure un temporizador durante 10 minutos.NOTA: Adherirse a los tiempos recomendados y al régimen de temperatura para lograr resultados de fijación reproducibles. Después de incubar durante 10 min, transfiera el cultivo a las botellas de centrífuga preenfriadas y gine las células por centrifugación a 4 °C, 5.000 x g durante 5 min. Mientras este giro está encendido, preenfríe un tubo de 50 ml y mantenga el tampón A recién preparado (que contiene glicina para neutralizar cualquier formaldehído restante) en hielo.NOTA: Consulte la tabla suministrada para conocer las composiciones exactas del búfer. Después de centrifugar, coloque los tubos de la centrífuga sobre hielo con el lado del pellet en contacto con el hielo. Lleve los tubos a la campana extractora de humos y deseche el sobrenadante en un contenedor de residuos de formaldehído. Resuspender el pellet celular de todos los tubos en 20 mL de tampón A usando una stripette de 25 mL y transfiriéndolo a un tubo de 50 mL.NOTA: Este lavado es fundamental para evitar la reticulación irreproducible y la adición del búfer no debe exceder los 20 minutos de tiempo desde la cosecha de las células. Hacer el volumen hasta 40 mL con tampón A y recoger las celdas lavadas por centrifugación a 4 °C, 5.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 40 ml de tampón A1, que es el tampón A que no contiene glicina, para eliminar cualquier contaminación por glicina. Células de pellets de nuevo por centrifugación a 4 °C, 5.000 x g durante 5 min. Repita los lavados con tampón A1 una vez más. Deseche el sobrenadante y coloque el gránulo celular sobre hielo. Pesar el tubo con el pellet (la masa celular húmeda debe ser de ~ 1 g por 1 L del cultivo celular). Alteración de las células de levadura y recolección de citosol Llene una caja de espuma de poliestireno forrada con papel de aluminio con nitrógeno líquido a una profundidad de aproximadamente 3 cm. Coloque un tubo de 50 ml en posición vertical en la caja. Resuspend el pellet (~1 g de masa celular húmeda) en 550 μL de tampón A2 mediante pipeteo y vórtice durante 10 s. Añadir 10 μL de 40 U/μL de inhibidor de la RNasa y vórtice de nuevo durante 10 s.PRECAUCIÓN: Use el equipo de protección adecuado, como guantes con aislamiento térmico, cuando manipule nitrógeno líquido. Asegúrese de que cualquier recipiente utilizado para contener nitrógeno líquido no tenga fugas, y que el estante de tubos en el interior no flote ni caiga de lado. Trabaje en un área bien ventilada para evitar el agotamiento del oxígeno. Usando una pipeta de 1 ml, gotee la suspensión celular en el tubo de 50 ml que contiene el nitrógeno líquido.NOTA: El goteo debe realizarse lenta y cuidadosamente para evitar la agregación de las gotas. Asegúrese de que las gotas se congelen antes de introducir nuevas gotas. Transfiera el tubo de 50 ml con las gotas de suspensión de celdas congeladas a temperatura ambiente y espere hasta que el nitrógeno líquido se evapore por completo. Selle el tubo con su tapa y guarde los gránulos de la celda a -80 °C o continúe inmediatamente.PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el nitrógeno líquido esté completamente evaporado antes de sellar el tubo. El nitrógeno líquido sobrante en un tubo sellado puede causar una acumulación de presión peligrosa. Para prepararse para el siguiente paso, preenfríe tubos sin nucleasa de 1,5 ml y frascos de molienda de acero inoxidable de 10 ml sobre hielo seco. Transfiera las gotas de suspensión de células congeladas a los frascos usando una espátula limpia y estéril.PRECAUCIÓN: Asegúrese de que los frascos de molienda estén bien sellados. Sumerja los frascos de molienda en el nitrógeno líquido durante 1 minuto asegurando que la fase líquida permanezca debajo de la unión. Instale un molino criomecallista a 27 Hz para agitar durante 1 minuto.NOTA: Siempre equilibre el recipiente de molienda con otro del mismo modelo, incluso si la muestra requiere solo un recipiente para el procesamiento. Agitar los frascos de molienda sellados a 27 Hz durante 1 min en el molino mezclador. Vuelva a enfriar los frascos de molienda en nitrógeno líquido como antes y agite a 27 Hz durante 1 minuto más en el molino mezclador. Transfiera los frascos a la caja de hielo que contiene hielo seco junto con los tubos libres de nucleasa de 1.5 ml. Usando una pequeña espátula de acero, transfiera la muestra en polvo resultante a los tubos en alícuotas de ~ 100 mg y almacene los tubos a -80 ° C.NOTA: Se recomienda utilizar ~ 600 mg de la muestra por experimento que comprende el análisis del perfil de sedimentación de polisomas, la separación del citosol en fracciones traducidas y no traducidas, y la separación adicional de la fracción traducida en SSU, ribosoma y fracciones de disome en la digestión de la RNasa. Separación de los complejos (poli)ribosómicos fijos de las fracciones no traducidas del citosolNOTA: El procedimiento establecido anteriormente10,38generalmente se sigue para enriquecer el ARN traducido en función de su co-sedimentación con (poli)ribosomas. Aquí se introduce un enfoque más refinado para separar las fracciones de citosol traducidas y no traducidas, eliminando la necesidad de precipitar y posteriormente re-solubilizar el material.Preparar gradientes lineales de sacarosa de 2,5 ml al 10% -20% p/v con tampón B utilizando el método de congelación-descongelación43 en tubos de ultracentrífuga de pared delgada (5 mL, 13 x 51 mm).NOTA: El método de congelación-descongelación se realiza mediante la adición secuencial y la congelación de capas de sacarosa tamponadas con concentraciones linealmente regresivas una encima de la otra. Para más detalles, véase el cuadro complementario 1. Para crear un cojín discontinuo de sacarosa al 50% p/v, sobre los gradientes lineales descongelándose y estabilizándose, dispense lentamente 0,5 ml de sacarosa al 50% en tampón B directamente en la parte inferior de los tubos utilizando una jeringa de 1 ml unida a una aguja de 19 G x 1,5″ o un capilar de vidrio de dimensiones similares / adecuadas. Antes de dispensar, conduzca con cuidado y lentamente la punta de la aguja o capilar de arriba a abajo de los gradientes de sacarosa preformados, evitando cualquier perturbación, hasta que llegue al fondo del tubo.NOTA: Consulte el cuadro complementario 1 para obtener instrucciones sobre la preparación del tampón B. Equilibre cuidadosamente los gradientes eliminando las porciones superiores o colocando capas de más de 10 w / v de sacarosa en el tampón B y manténgalos helados o a 4 ° C.NOTA: El gradiente discontinuo con la capa inferior de sacarosa al 50% es necesario para recolectar material con mayor velocidad de sedimentación sin precipitarlo en la pared del tubo. Descongele ~ 100 mg de la muestra en polvo de célula congelada a temperatura ambiente e inmediatamente colóquela en hielo. Mezclar en 150 μL de tampón A2 mediante pipeteo, añadir inhibidor de la RNasa a 1 U/μL y mezclar por vórtice (evitar la formación excesiva de espuma y la mezcla con la fase gaseosa) durante 10 s.NOTA: Continúe todas las operaciones mientras mantiene el material en hielo, a menos que se indique lo contrario. Granular los restos celulares centrifugando los tubos a 4 °C, 13.000 x g durante 5 min y recuperar el sobrenadante clarificado (~150 μL) en un nuevo tubo de unión a proteínas bajas de 1,5 ml. Cargue la mezcla clarificada resultante en los tubos de gradiente de sacarosa discontinuos del paso 1.3.3 y equilibre cuidadosamente. Ultracentrífuga los tubos en un rotor de cucharón oscilante de volumen medio a 4 °C, con fuerza g media de 287.980 x g (factor k 49) durante 1 h 30 min.NOTA: Estas condiciones se han optimizado previamente (utilizando análisis de trazas de absorbancia UV de gradiente de gradiente de ultracentrifugación) para retener las SSU libres (no (poli)ribosómicas) y las LSU (subunidad ribosómica grande) en la parte superior (10% -20% sacarosa) del gradiente mientras se concentra la fracción (poli)ribosómica en el colchón de sacarosa inferior (50%) sin peletizar el material. Utilice una nueva jeringa estéril de 1 ml equipada con una aguja de 19 G x 1,5″ para recoger la fracción de citosol traducida. Coloque el gradiente de 5 ml en un bastidor estable asegurándose de que la parte inferior del tubo sea visible. Desde la parte superior del tubo, pegue la aguja directamente en la parte inferior del gradiente (sin perforar el tubo) y suavemente, sin crear burbujas, extraiga exactamente 0,5 ml de la solución inferior que contiene el grupo de ARN traducido.NOTA: Asegúrese de que este paso se realice en una cámara frigorífica y que el tubo se mantenga firmemente. Se recomienda dibujar los 0,5 ml completos en un solo movimiento hacia arriba para evitar la perturbación del gradiente. Confirme la presencia (poli)ribosómica y el agotamiento de la SSU, LSU y fracciones más ligeras en la mezcla resultante mediante la lectura de absorbancia del gradiente de sacarosa en la ejecución de ultracentrifugación. Concentre el grupo de ARN traducido recolectado del paso anterior a 100 μL utilizando ultrafiltración en un dispositivo de microconcentración con membrana de celulosa regenerada de corte de 10 kDa.NOTA: Lave previamente la membrana del dispositivo de microconcentración con 0,5 ml de tampón 1 (consulte la Figura 2a)y utilice las condiciones de centrifugado(g)recomendadas por el fabricante. Diluya aún más el material del paso anterior cinco veces (agregue 400 μL) con el tampón 1 y concentre de nuevo a 200 μL, para permitir un volumen más pequeño, así como la eliminación parcial de la sacarosa.NOTA: Se recomienda almacenar las mezclas resultantes a -80 °C durante un máximo de 6 meses y utilizarlas como material de entrada para la construcción de la biblioteca de ARN-seq de “ARN traducido total”, o la etapa de digestión de la RNasa de la construcción de la biblioteca TCP-seq. La fracción de citosol “no traducida” puede recuperarse de la parte superior del gradiente mediante un procedimiento similar y almacenarse a -80 °C. Digestión de la RNasa de los complejos (poli)ribosómicos fijos y separación del material digerido en pequeñas fracciones ribosómicas (SSU), monoribosomales (ribosomas, RS) y diribosomales (disomes, DS)NOTA: El procedimiento generalmente sigue un enfoque descrito anteriormente10,38pero se emplea un tipo de gradiente modificado, tiempo de separación, aceleración y condiciones de digestión de la RNasa, para lograr la mejor resolución en las tres fracciones aisladas.Prepare gradientes de sacarosa lineales cuidadosamente equilibrados de 12,5 ml al 10% -40% p/v realizados con tubos de polipropileno de pared delgada tampón 1 en 13 ml, 14 x 89 mm, utilizando el método de congelación-descongelación43 como se describe en el paso 1.3.1 y tenga en cuenta lo mismo. Descongelar a temperatura ambiente y transferir inmediatamente las muestras sobre hielo o tomar la fracción de citosol traducida concentrada y agotada con sacarosa del paso 1.3.12.NOTA: Continúe todos los procedimientos en hielo a menos que se indique lo contrario. Digerir la fracción de citosol traducida mezclando en 4,5 U de E. coli RNasa I por 1 OD260 unidad de la fracción durante 30 min a 23 °C. Añadir y mezclar inmediatamente mediante pipeteo del inhibidor de la RNasa capaz de inactivar la RNasa I a 0,25 U/μL a la mezcla, para inactivar la RNasa I.NOTA: Utilice el inhibidor de la RNasa capaz de inhibir la RNasa I. Derive AU260 mediante el uso de AU260 = (Absorbancia a 260 nm estandarizada a unidades de densidad óptica equivalentes a 1 cm de trayectoria óptica x volumen del lisado en μL) / 1.000. Transfiera inmediatamente las muestras al hielo.PRECAUCIÓN: Es fundamental cumplir con las condiciones recomendadas de digestión y medir cuidadosamente la cantidad de RNasa I agregada. La unidad RNasa I a la que se hace referencia aquí se define como la cantidad de la enzima requerida para producir 1 μg de material soluble en ácido a partir de ARN hepático de ratón en 30 min a 37 °C. Los lotes de RNasa I pueden tener variaciones indocumentadas en la actividad y pueden requerir experimentación para lograr condiciones óptimas de digestión. Si el stock de enzimas está demasiado concentrado, se recomienda diluirlo con tampón 1 para evitar pipetear volúmenes muy pequeños de la solución. Cargue las mezclas de reacción en los gradientes de sacarosa de 10%-40% p/v del paso 1.4.1.NOTA: Utilice volúmenes finales en el rango de 150-300 μL por gradiente. Cada purificación requiere un mínimo de dos gradientes. Utilice diferentes volúmenes de entrada del material (más bajo AU260,10-11 AU260,para DS y comparativamente más alto AU260,13-14 AU260,para SSU o RS) para lograr una separación óptima. Ultracentrífugo los tubos en un rotor de cucharón oscilante de volumen medio a 4 °C con fuerza g media de 178.305 x g (factor k 143,9) durante 3 h 30 min.PRECAUCIÓN: Si se necesitan tubos de equilibrio de repuesto, iguale su masa y distribución de masa con los tubos que contienen la muestra. Utilice gradientes de sacarosa de repuesto superpuestos con una cantidad de tampón equivalente a la de la superposición de muestra y no tubos con concentración uniforme de sacarosa. Configure un dispositivo de fraccionador de gradiente al menos 30 minutos antes de la finalización del centrifugado de ultracentrifugación, incluido el llenado de la solución de persecución pesada filtrada de 0,2 μm (por ejemplo, sacarosa al 60% en agua desionizada como se usa aquí) en la bomba de desplazamiento.NOTA: Se recomienda descontaminar las líneas y tubos del fraccionador utilizando agua desionizada, seguido de una solución de SDS al 1% -2% en agua desionizada, agua desionizada y, finalmente, etanol al 80% en solución de agua desionizada antes y después de las corridas. Ajuste la línea de base de lectura de absorbancia llenando primero el sistema con agua desionizada y poniendo a cero la óptica según las recomendaciones del fabricante, y luego compensando el cambio de línea de base utilizando un gradiente de sacarosa descargado de repuesto de 14 x 89 mm hecho con un tampón idéntico a los tubos de muestra (por ejemplo, tampón 1).NOTA: Utilice la misma velocidad de desplazamiento para realizar los ajustes que para la lectura de la muestra, como 1,5 ml/min. Mida el volumen muerto del sistema de desplazamiento contando con precisión el tiempo entre la solución que ingresa por primera vez a la trayectoria óptica del detector y aparece por primera vez en la salida del colector de fracción.NOTA: Con la velocidad recomendada de 1,5 mL/min, el fraccionamiento se puede realizar a temperatura ambiente. Se recomienda transferir inmediatamente las fracciones recolectadas en hielo. Realice el fraccionamiento utilizando la lectura de absorbancia en vivo a 254 nm, la velocidad de desplazamiento de 1,5 ml / min y la detección de fracciones en línea en función de la posición de sedimentación esperada y el perfil de absorbancia de las muestras. Utilice la conmutación del tubo colector con un retardo de tiempo correspondiente al volumen muerto medido anteriormente. Aislar las fracciones correspondientes a las posiciones y movilidad de los complejos SSU, RS y DS y recogerlas en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de baja unión a proteínas; transfiera inmediatamente las fracciones aisladas en hielo y congele si no se procesa más de inmediato.NOTA: Se recomienda congelar inmediatamente las fracciones recolectadas en hielo seco o nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 °C o menos durante un máximo de 6 meses. Des-reticulación de los complejos ribosómicos y aislamiento del ARN para construir bibliotecas RNA-seq Para desbloquear/invertir los enlaces cruzados y aislar el ARN de las proteínas asociadas, transfiera aproximadamente la mitad de todas las fracciones de gradiente de sacarosa a nuevos tubos de microcentrífuga de polipropileno sin nucleasa de baja unión a ácido nucleico de 1,5 ml (350 μL por tubo) con dispositivos de seguridad / bloqueo de la tapa. Suplementar las mezclas con 40 μL de solución de parada al 100% (10% SDS p/v y 100 mM EDTA), 4 μL de 1 M Tris-HCl pH 2 a 25 °C (a 10 mM), 1,6 μL de 2,5 M de glicina (a 10 mM) y agua libre de nucleasa desionizada para obtener el volumen final de 400 μL. Mezcle el contenido de los tubos mediante pipeteo y transfiera los tubos a temperatura ambiente. Agregue el mismo volumen de la mezcla ácida de fenol: cloroformo: alcohol isoamilo 125: 24: 1 (pH 4.0-5.0) a cada tubo. Agite vigorosamente las mezclas durante 2 minutos con un mezclador de vórtice ajustado a la velocidad máxima.PRECAUCIÓN: El fenol y el cloroformo son corrosivos y tóxicos. Evite el contacto físico con los líquidos y trabaje en un área bien ventilada o debajo de una campana de humos. Siempre use guantes, bata de laboratorio y gafas protectoras o un protector facial cuando trabaje con fenol o cloroformo. Coloque los tubos en un termoescalizador y agite continuamente a 65 °C, 1.400 rpm durante 30 min. Facilitar la agregación de fases centrifugando la mezcla a 12.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Recoja las fases acuosas superiores y transfiéralas a tubos frescos de 1,5 ml de unión a ácidos nucleicos bajos.NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, no intente recuperar las fases acuosas por completo. Un volumen de recuperación razonable es de 300-350 μL. Complementar las fases acuosas recogidas con 0,1 volúmenes de 3 M de acetato de sodio (pH 5 a 25 °C), 20 μg de glucógeno (utilizando 5 μg/μL de caldo) y 2,5 volúmenes de etanol absoluto. Mezcle cuidadosamente las soluciones vórtice los tubos durante 1 min. Precipitar el ARN incubando las muestras a -20 °C durante al menos 2 h (recomendado durante la noche). Calentar los tubos a temperatura ambiente y mezclar mediante vórtice.NOTA: El precalentamiento de los tubos y la posterior centrifugación a temperatura ambiente (sin enfriamiento forzado) ayudan a reducir la coprecipitación y el arrastre de sal y fenol. Estas condiciones no deben dar lugar a la pérdida de material o la ineficiencia de la recolección de ARN si se realiza como se describe y utilizando etanol suficientemente puro. Granular el precipitado de ARN centrifugando los tubos a 12.000 x g durante 30 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y lave el pellet dos veces con etanol al 80% v/v, recogiéndolo cada vez por centrifugación a 12.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Seque los gránulos de ARN abriendo las tapas de los tubos y colocando los tubos abiertos en un calentador de bloque seco a 45 °C durante 10 min. Disuelva el pellet seco resultante en 20 μL de 1x tampón HE. Estimar la concentración de ARN resultante utilizando la medición del espectro de absorbancia UV.NOTA: La longitud del fragmento de ARN y la cantidad total se pueden evaluar más a fondo utilizando electroforesis en gel desnaturalizante, como en un aparato automatizado de electroforesis de gel capilar basado en fluorescencia. Coinmunopurificación selectiva de las SSU mediante los eIF etiquetados y análisis de western blot del enriquecimiento selectivo de SSUNOTA: Utilice ~ 15 UA (260 nm) de la fracción SSU digerida y segregada por sedimentación del paso 1.4.11 para realizar la purificación de afinidad utilizando perlas magnéticas de IgG. Guarde ~ 5% de la fracción SSU como control de entrada (fracción de entrada, I). Etiquetado eIF4A (TIF1-TAP; Tandem Affinity Purification tag) se utilizó una cepa de levadura que también permite detectar eIF4A mediante el sondeo de la etiqueta TAP utilizando anticuerpos anti-TAP.Transferir 100 μL de suspensión magnética de perlas de IgG (se utilizó 1 mg de las perlas por cada 15 UA (260 nm) del lisado o fracción) a un nuevo tubo de 1,5 ml de baja unión a proteínas; recoger las cuentas mediante bastidor magnético y aspirarlas. Lave las perlas magnéticas dos veces con 1 ml de tampón 1 mediante el uso de la resuspensión secuencial mediante pipeteo y recolección utilizando el bastidor magnético. Después del lavado, recoja y decante las cuentas, mientras las mantiene en la rejilla magnética. Agregue la fracción SSU a las perlas lavadas e incube la mezcla durante 4 h con rotación a 4 ° C en un ciclomezclador a ~ 20 rpm. Recoja las perlas utilizando el bastidor magnético a 4 °C y guarde el sobrenadante (fracción de flujo continuo, FT). Lave las perlas dos veces a 4 °C con el tampón 1 complementado con TDT de 4 mM, girando cada vez durante 10 min en el ciclomezclador y recogiendo y decantando las perlas en el bastidor magnético. Guarde los lavados (fracciones W1 y W2). Para una aplicación analítica como western blotting, eluya el material unido en condiciones de desnaturalización y reducción agregando un tampón de muestra de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) LDS (sulfato de dodecilamida de litio) con pH 8.5 a 1x y TDT a 2 mM. Calentar la mezcla a 95 °C durante 5 min en un bloque térmico para finalizar la elución. Recoja las perlas utilizando la rejilla magnética y recupere el eluido desnaturalizado (fracción E) en un tubo de microcentrífuga fresco de baja unión a proteínas de 1,5 ml. Utilice la fracción E del paso anterior para ejecutar inmediatamente una página de desnaturalización de dodecil sulfato de sodio (SDS) o almacene la fracción E a -20 °C.NOTA: Para una colección preparativa de los complejos traslacionales enriquecidos con etiquetas TAP para cualquier aplicación posterior, utilice un enfoque de elución alternativo que emplee la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). Consulte el cuadro complementario 1 para obtener más detalles. Para concentrar las fracciones diluidas FT, W1 y W2, precipitar su material agregando 3x volúmenes de acetona helada. Incubar la mezcla muestra-acetona a -20 °C durante 3 h. Granular el precipitado centrifugando los tubos a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet en los tubos abiertos a temperatura ambiente durante 30 min. Disolver el pellet en 7 μL de 1x tampón de carga LDS suplementado con 2 mM de TDT. Calentar las muestras en un bloque térmico ajustado a 95 °C durante 5 min. Cargue todas las muestras I, FT, W1, W2 y E en un 4% -12% p/v de gradiente de acrilamida, gel desnaturalizante de poliacrilamida Bis-Tris. Ejecute el gel usando 1x MES SDS (2- [N-mopholino]ethanesulfonic acid, sodium dodecyl sulfate) corriendo tampón a 80 V, hasta que el marcador de proteína (10-250 kDa) se resuelva bien y el tinte de plomo llegue al fondo del gel.NOTA: Se recomienda cargar diluciones seriadas del WCL (lisado de células enteras) (2-10 μg) en el gel como control. Puede tomar varios intentos para lograr una carga comparable del gel a través del material de la fracción. Transfiera el contenido de proteína del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) por método de transferencia húmeda a 100 V durante 1 h en una cámara frigorífica según lo recomendado por el fabricante de equipos de western-blotting. Bloquee la membrana utilizando un tampón de bloqueo apropiado (a base de solución salina tamponada con fosfato) a temperatura ambiente durante 1 h bajo agitación constante. Siguiendo las instrucciones del fabricante para la dilución de anticuerpos, sondee la membrana con anticuerpos anti-TAP para detectar la proteína eIF4A etiquetada, el anticuerpo anti-Pab1p o el anticuerpo anti-β-actina (o cualquier otro objetivo deseable) mediante la incubación nocturna de la membrana con el anticuerpo diluido de Blocking Buffer (PBS) (dilución 1: 1,000) en un ciclomezclador en una cámara frigorífica.NOTA: La dilución de anticuerpos 1:1.000 es un buen punto de partida. Lave la membrana tres veces con 1x Solución salina tamponada con fosfato, 0.2% v / v Tween 20 (PBST) durante 10 min cada uno. Sondee la membrana con anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente siguiendo las instrucciones del fabricante incubando en un ciclomezclador a temperatura ambiente durante 1 h.NOTA: La dilución de anticuerpos 1:20,000 es un buen punto de partida. Lave la membrana tres veces con 1x PBST durante 10 min cada uno. Enjuague brevemente la membrana con agua desionizada y luego con metanol absoluto. Seque y visualice la membrana en un sistema de imágenes fluorescentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante.NOTA: La tinción de otras proteínas se puede lograr mediante el uso de anticuerpos secundarios con colorantes que coincidan con diferentes canales fluorescentes (como en el par eIF4A-TAP vs. β-actina utilizado aquí), mediante tinción secuencial o extracción y tinción de la misma membrana o cortando la membrana de un gel cargado con un patrón repetitivo de fracciones y sondeando por separado cada pieza con anticuerpos respectivos (como en el ejemplo Pab1p utilizado aquí). 2. Protocolo de células de mamíferos Cultivo y fijación de células de mamíferos En 2 matraces T-175, cultive células HEK293 a 60%-70% de confluencia en el Medio Águila Modificada de Dulbecco y 10% v/v Fetal Bovino Suero a 37 °C y 5% v/v dióxido de carbono.NOTA: El medio completo se fabrica agregando 55 ml de FBS comercial en 500 ml de DMEM comprado comercialmente con alta glucosa, que contiene L-glutamina, rojo fenol y bicarbonato de sodio, pero no HEPES o piruvato de sodio. Los recuentos de células por matraz T-175 al 70% de confluencia deben estar en el rango de 1.7-2.0 x 107. Al menos 3 h antes del tiempo de fijación deseado, reemplace los medios de los matraces T-175 con exactamente 30 ml de medios completos precalentados y reemplace los matraces en una incubadora de células.NOTA: Asegúrese de que el medio fresco se pipetee en el lado opuesto del matraz a la monocapa celular para evitar el desprendimiento de la celda. Intente llevar a cabo el intercambio de medios lo más rápido posible, introduciendo una perturbación mínima del equilibrio de gas y temperatura. Una vez que el medio celular ha sido reemplazado, prepare los tampones y los productos químicos necesarios para la fijación. Prepare la solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco con 50 mM de glicina agregando 10.2 mL de caldo de glicina de 2.5 M a una botella de 500 mL de DPBS y mezclando. Prepare una botella de DMEM suplementada con 10% de FBS como en el paso 2.1.1 para ser utilizado en condiciones no estériles y una alícuota de 100 ml de tripsina-EDTA al 0,25%. Obtenga una botella adicional de DPBS comercial preformulada con cloruro de calcio (CaCl2)y cloruro de magnesio (MgCl2).NOTA: Las soluciones se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas. Prepare una caja de hielo hasta el borde con hielo de agua triturada de tal manera que un matraz T-175 pueda caber uniformemente en la parte superior y mantenerse en la campana de humos junto con los amortiguadores preparados, también en hielo.NOTA: Debido a las rápidas respuestas de la traducción a cualquier cambio ambiental, se deben minimizar todos los tiempos entre la eliminación de los matraces celulares de la incubadora y la adición de la solución de formaldehído. Para enfriar las células, retire el matraz T-175 de la incubadora y presiónelo firmemente contra el hielo asegurando el máximo contacto con la superficie. Dentro de la campana de humos químicos, incline el matraz hacia un lado para que el medio se acumule en el lado opuesto a las células. Pipete 168 μL de 37% p/v formaldehído directamente en el medio agrupado (a una concentración final de 0,2% p/v). Mezcle inmediatamente balanceando suavemente el matraz hacia adelante y hacia atrás, cierre y vuelva a colocar el matraz en hielo, asegurándose de que sea horizontal y que las celdas estén cubiertas uniformemente.PRECAUCIÓN: El formaldehído es una sustancia nociva con posibles efectos adversos a largo plazo y también un irritante tanto para el sistema respiratorio como para la piel. Solo debe manipularse en una campana de humos químicos adecuada. Los recipientes de formaldehído siempre deben sellarse cuando estén fuera de la campana extractora.NOTA: Asegúrese de que el formaldehído se agrega directamente en el medio celular y no en la pared del matraz. El paso 2.1.6 debe tardar menos de 1 minuto. Incubar los matraces en hielo durante otros 10 minutos. Vierta el medio en un recipiente de desechos apropiado a través del lado del matraz opuesto a las celdas. Usando una stripette, pipeta en 30 mL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin iones de calcio y magnesio y que además contiene 50 mM de glicina, suavemente en el lado opuesto a las células. Mezclar meciendo el matraz; Devolver el matraz a posición horizontal e incubar durante 10 minutos más sobre hielo. Vierta la solución a través del lado del matraz opuesto a las células y agregue suavemente 7 ml de la solución estándar de tripsina-EDTA al 0,25% p/v para separar y resuspendir las células. Incubar el matraz a temperatura ambiente durante 5-10 min.NOTA: Asegúrese de que la solución de tripsina-EDTA cubra todas las células de manera uniforme. Use una inclinación y balanceo suaves y periódicos para promover el desprendimiento celular. Reubique el matraz verticalmente y, con una stripette, recoja las celdas separadas lavando suavemente las celdas restantes de las paredes del matraz. Transfiera la suspensión a un tubo de 50 ml sobre hielo.NOTA: Las células fijas pueden volverse más frágiles; no pipetear intensamente o más de lo que se requiere para separar las células de la pared del matraz. Complemente inmediatamente la suspensión celular recolectada con 20 ml de medios completos (el medio helado no estéril con 10% de FBS) y mezcle volteando suavemente el tubo.NOTA: Se agrega el medio de cultivo celular completo (incluido el 10% de FBS) para neutralizar la tripsina, evitando un mayor daño a las membranas celulares y la desintegración celular. Granular las células centrifugando el tubo a 100 x g durante 5 min y 4 °C. El pellet celular debe ser claramente visible. Vierta el medio y vuelva a suspender suavemente el pellet celular en 10 ml de DPBS helado con Ca2+,Mg2+y sin glicina. Repita el paso 2.1.12. Vierta el tampón de lavado y vuelva a suspender suavemente el pellet celular en 800 μL de DPBS helado con Ca2+,Mg2+,sin glicina, sobre hielo. Transfiera las células resuspendidas a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 ml. Centrifugar el tubo a 100 x g durante 3 min y 4 °C. Deseche cuidadosamente el sobrenadante con un pipeteador de 1 ml. En esta etapa, el pellet celular se puede congelar a -80 ° C o proceder a la etapa de lisis celular.NOTA: Los pellets de células congeladas se pueden almacenar a -80 °C hasta 1 año. Se encontró que la congelación de pellets celulares facilita la lisis posterior y recomendamos la congelación incluso si no se planea el almacenamiento a largo plazo. Alteración celular de mamíferos y recolección de citosol En un gabinete de bioseguridad, agregue 300 μL del tampón de lisis a base de detergente no iónico no desnaturalizante y 7 μL de inhibidor de la RNasa de 40 U/μL. Mezclar bien mediante pipeteo con una punta de 1 ml. Conecte cuidadosamente una aguja de 25 G a una jeringa de 1-3 ml y pipetee vigorosamente la mezcla, utilizando al menos siete golpes de admisión lenta hacia arriba y rápido hacia abajo. Deseche la jeringa y la aguja en un contenedor de objetos punzantes y repita el procedimiento con una jeringa de 0,3 ml equipada con una aguja de 31 G. Deseche la jeringa y la aguja en un contenedor de objetos punzantes. Centrifugar los tubos a 4 °C, 12.000 x g durante 5 min para granular los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 ml. Almacene tanto los restos celulares (para fines de control) como el lisado celular clarificado resultante a -80 °C.NOTA: La densidad óptica del lisado oscila entre 25-30 UA260 cuando se combinan dos matraces T-175 y se siguen los volúmenes recomendados. Los lisados y los restos celulares se pueden almacenar a -80 °C hasta 1 año. Separación de los complejos (poli)ribosómicos fijos de las fracciones no traducidas del citosol Preparar gradientes lineales de sacarosa de 15%-45% p/v en tubos de polipropileno de pared delgada de 13 ml, 14 x 89 mm, utilizando el método de congelación-descongelación generalmente como se describe en el paso 1.3.1 del protocolo de levadura, pero utilizando el tampón 2(Figura 2a).NOTA: Descongelar los gradientes durante la noche en una cámara frigorífica a 4 °C la noche anterior al fraccionamiento. Cargue 150-250 (máximo 300) μL del lisado celular del paso anterior 2.2.5 en los gradientes equilibrados. Conservar el lisado restante a -80 °C y utilizarlo con fines de control.NOTA: Aquí se proporciona un ejemplo de segregación basada en sedimentación en fracciones SSU polisomales, ribosómicas y “libres”. Consulte el cuadro complementario 1 proporcionado para obtener un enfoque alternativo. Ultracentrífugo de los tubos en un rotor de cucharón oscilante de volumen medio a 4 °C, fuerza g promedio 178,305 x g (factor k 143.9) durante 1 h 45 min. 30 minutos antes de la finalización del espín, configure y ponga en línea de base el fraccionador de gradiente, como se describe en los pasos del protocolo de levadura 1.4.7-1.4.9. Fraccionar los gradientes generalmente como se describe en los pasos del protocolo de levadura 1.4.10-1.4.11.NOTA: Este paso separará las fracciones de SSU polisomales, ribosómicas y ‘libres’. Las fracciones polisomales se pueden utilizar en experimentos de perfilado de polisomas. Transfiera inmediatamente las fracciones recolectadas en hielo y, si no se procesan más, guárdelas a -80 ° C hasta 6 meses.NOTA: Si el cambio del tubo del colector de fracciones está sincronizado con la identificación y segregación de la fracción en línea, recomendamos utilizar fracciones de hasta 800 μL (tiempo de recolección de 32 s por fracción a 1,5 mL/min). Si el fraccionamiento se realiza sin utilizar la lectura de absorbancia en línea, se recomienda utilizar fracciones de 250-500 μL (10-20 s por fracción a 1,5 mL/min). Después de la separación, las fracciones pueden ser utilizadas para inmunopurificación, microscopía electrónica, desnaturalización de PAGE y western blotting de inmediato, o sometidas a reversión de reticulación para posteriores análisis de ARN y/o proteómica.

Representative Results

Los complejos traslacionales son sensibles a la composición iónica de los tampones, lo cual es particularmente importante durante la ultracentrifugación donde se evalúan las propiedades de sedimentación. Por lo tanto, probamos varios tampones de sedimentación utilizando lisado clarificado extraído de material de levadura no fija molido, con el fin de seleccionar las condiciones más adecuadas para resolver complejos traslacionales y separar subunidades ribosómicas (SSU, LSU), monosomas (RS) y polisomas a través del gradiente. Todos los buffers se basaron en la composición del núcleo que contenía 25 mM HEPES-KOH pH 7,6 y 2 mM TDT. Las concentraciones de KCl, MgCl2,CaCl2y EDTA se modificaron aún más en todos los tampones(Figura 2a),y estos componentes se agregaron a los lisados antes de la carga del gradiente y a los tampones del gradiente de sacarosa antes de la fundición del gradiente, en consecuencia. En los buffers se obtuvieron 1 y 2 complejos traslacionales bien resueltos. El tampón 1 dio como resultado una separación algo mejor de las pequeñas subunidades ribosómicas (SSU) (Figura 2a). La omisión de MgCl2 y la adición de EDTA (tampones 3,4) causaron la pérdida de las altas propiedades de sedimentación para la mayoría de los polisomas y probablemente su desmontaje parcial(Figura 2a). Si bien la adición de 2,5 mM de CaCl2 dio lugar a picos polisomales algo más homogéneos, la mejora fue marginal y la cantidad total del material polisomal disminuyó en este caso(Figura 2a)en comparación con los tampones 1 y 2. Por lo tanto, seleccionamos el búfer 1 como el búfer de trabajo de elección. Figura 2: Condiciones tampón para la extracción del complejo traslacional y evaluación del efecto estabilizador de la fijación. Se muestran perfiles de absorbancia UV recolectados a 260 nm para el lisado total de células de levadura separados en gradientes de sacarosa del 10% al 40% p/v. a) Efectos de las sales mono y divalentes y del secuestro de iones de magnesio sobre la sedimentación del material extraído de células de levadura no fijas. Las líneas rojas y grises representan una réplica típica. b,c) Comparación de lisados derivados de células de levadura fijas (línea gris), 2,2% (línea negra) y 4,4% (línea punteada negra) p/v de células de levadura fijadas en formaldehído. ( d) Estabilización de polisomas por el 0,2% p/v optimizado de fijación de formaldehído (línea negra discontinua y punteada) de células HEK 293T, en comparación con el material de las mismas células no fijas (línea gris). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. A continuación, comprobamos el efecto de la estabilización polisomal por fijación con diferentes concentraciones de formaldehído. Utilizando el mismo material celular, tampones, manejo celular y enfoques de sincronización, comparamos el material extraído de células no fijas y células fijas con 2.2% y 4% p/v de formaldehído(Figura 2b,c). Encontramos que el 2,2% p/v de formaldehído era más adecuado para la fijación, ya que si bien preservó excelentemente los polisomas como se puede juzgar por la relación polisoma-monosoma(Figura 2b),no redujo el rendimiento general del material ribosómico en comparación con el 4% p/v de formaldehído, que mostró claros signos de fijación excesiva(Figura 2c). Para el material derivado de células de mamíferos, debido a la mayor relación de volumen de tampón de lisis a célula requerida por la extracción a base de detergente, se utilizó el tampón2 (Figura 2a). Esto produjo complejos traslacionales bien resueltos tras la sedimentación en gradientes de sacarosa (Figura 2d). En particular, se utilizó una concentración mucho menor de formaldehído de 0,2% p/v, ya que las concentraciones más altas dieron lugar a una pérdida sustancial de material polisomal y ribosómico (datos no mostrados). En similitud con los resultados obtenidos con células de levadura, el material estabilizado de reticulación demostró una mejor preservación de los polisomas y una mayor relación polisoma-monosoma(Figura 2d). A continuación, probamos si las condiciones de fijación de formaldehído seleccionadas son lo suficientemente eficientes como para estabilizar el ARNm traducido activamente dentro de las fracciones polisomales como resultado de la reticulación, y el rendimiento polisomal mejorado no es solo una consecuencia de la inhibición de la función enzimática y la progresión de la elongación de la traducción. Utilizamos EDTA y sal monovalente alta (KCl) para desestabilizar polisomas y ribosomas. Estos reactivos se agregaron a los lisados de células de levadura clarificados y se incluyeron en todos los tampones posteriores y gradientes de sacarosa en la parte superior de la composición del tampón 1, respectivamente. De hecho, 15 mM EDTA exhibió un menor efecto de desestabilización sobre las fracciones polisomales derivadas de las células fijas(Figura 3a),lo que confirma que los complejos reticulados son más robustos. Los efectos desestabilizadores del EDTA pueden superarse de alguna manera aumentando la concentración de formaldehído, ya que el material del 4% p/v de las células fijadas por formaldehído resiste el despliegue mejor(Figura 3a). Sin embargo, el aumento de la concentración de EDTA a 50 mM resultó en la desestabilización de la mayoría de los complejos traslacionales en condiciones fijas y no fijas, como se puede deducir de la sedimentación más lenta del material y la ausencia de picos bien formados(Figura 3b). Esto puede explicarse por el despliegue parcial de las estructuras y la pérdida general de compacidad, en lugar de por la disociación completa de los componentes polisomales del ARNm. Incluso en este caso, el material reticulado ha demostrado una sedimentación más rápida(Figura 3b). Figura 3: Efectos de la fijación de formaldehído de levadura in vivo sobre la estabilidad de los polisomas. El búfer 1 (véase el texto y la figura 2a)se utilizó en todos los experimentos. Tipo de datos y trazado como se describe en la leyenda de la figura 2. a) Comparación de la adición de 15 mM de EDTA a los lisados celulares y los tampones posteriores sobre la estabilidad de los polisomas derivados de células fijas (línea gris), 2,2 % (línea negra) y 4 % (línea punteada negra) p/v de células fijadas con formaldehído. b) igual que (a), pero para la adición de 50 mM de EDTA y excluyendo el 4% p/v de células fijadas con formaldehído. (c) igual que (a), pero para la adición de 500 mM KCl y excluyendo el 2,2% p/v de células fijadas con formaldehído. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Similar a los efectos del EDTA, a 500 mM KCl, encontramos una mejora importante de la estabilidad con un 4% p/v de fijación de formaldehído(Figura 3c). La aparente pérdida de compacidad en este caso también puede explicarse por el desprendimiento parcial de los constituyentes de los complejos ribosómicos, en lugar de su disociación completa del ARN. En general, los polisomas derivados de células fijadas por formaldehído demostraron una mayor resistencia al despliegue y la desestabilización estructural, consistente con la formación de enlaces covalentes adicionales dentro de estos complejos. Durante las condiciones de crecimiento estimulante, los ARNm pueden iniciarse rápidamente, lo que resulta en la acumulación de múltiples ribosomas en las mismas moléculas de ARNm, que forman estructuras conocidas como poliribosomas o polisomas. Los polisomas se pueden separar por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa, donde sedimentan en función de su orden (número de ribosomas unidos simultáneamente en arNm). Cuando se suprime la traducción, los ribosomas no logran participar en otra ronda de traducción lo suficientemente pronto, lo que resulta en un “desmontaje” (parcial) de los polisomas, que se exhibe como un cambio modal hacia los polisomas de un orden inferior y la acumulación de monosomas4,26. Un modelo de respuesta traslacional que se puede visualizar en el nivel de distribución del orden de polisomas puede ser proporcionado por la inanición de glucosa. El agotamiento de la glucosa provoca uno de los efectos inhibitorios traslacionales más dramáticos y rápidos sobre la levadura1,3,40. Estudios previos evidenciaron que dentro de 1 min de agotamiento de la glucosa, pérdida de polisomas, acumulación de monosomas e inhibición del inicio de la traducción puede ocurrir4. Dentro de los 5 minutos de re-suplemento de glucosa, la traducción se restaura rápidamente con un aumento evidente de los polisomas3,4. También se observó que la traducción se inhibió cuando las células se expusieron a medios que contenían glucosa de 0,5% (p/v) o menos y no se observó ningún efecto en los niveles de glucosa de 0,6% (p/v) o superior. Por lo tanto, se deseaba determinar si nuestras condiciones de fijación son adecuadas para la preservación de las diferencias traslacionales dentro de la dinámica de la respuesta al estrés de la glucosa, como puede evaluarse mediante la relación polisoma-monosoma. Comparamos el material de las células cultivadas en fase exponencial media con glucosa alta (2,00% p/v añadido) con las transferidas durante 10 min a medios con glucosa nula o baja añadida (0,00% o 0,25% p/v, respectivamente). La fijación se ha realizado utilizando 2,2% p/v de formaldehído en paralelo en el control (no hambriento; reemplazo rápido de medios con el mismo medio estándar que contiene 2% p/v de glucosa añadida, seguido de incubación durante 10 min y fijación) y 10 min hambrientos (reemplazo rápido de medios con el mismo medio pero bajo 0,25 p/v o sin glucosa añadida, seguido de incubación durante 10 min y fijación) células. De acuerdo con los hallazgos anteriores, observamos que las células de levadura suprimen en gran medida la traducción sobre el estrés por inanición de glucosa(Figura 4a). Tanto las condiciones de glucosa agregada como las de baja glucosa indujeron el desmontaje de polisomas, con un poco pero evidentemente más polisomas retenidos en el caso de la glucosa agregada baja. Por lo tanto, la respuesta de eliminación de glucosa de levadura puede no ser de un tipo all-on o all-off y se ajusta gradualmente. Afirmando las expectativas de la acción estabilizadora de la reticulación de formaldehído, el material polisomal de las células fijas ha demostrado una mayor distinción entre las células hambrientas y no hambrientas, posiblemente preservando un rango dinámico más alto de la respuesta(Figura 4b). Curiosamente, en el caso del material de las células fijas, la baja concentración de glucosa agregada resultó en la abundancia polisomal específica que se diferencia mucho mejor de la condición de no glucosa agregada, en comparación con las células no fijas(Figura 4a). Esta es una fuerte indicación de la idoneidad del enfoque de fijación de formaldehído para preservar y capturar diferencias relativamente diminutas y transitorias en el equilibrio de procesos altamente dinámicos, como durante las respuestas traslacionales. Figura 4: Captura de cambios rápidos en la traducción de levadura tras la inanición de glucosa. El búfer 1 (véase el texto y la figura 2a)se utilizó en todos los experimentos. Tipo de datos y trazado como se describe en la leyenda de la figura 2. (a ) Lisados celulares obtenidos de células de levadura no fijas no hambrientas (línea gris), restringidas de glucosa (0,25% p/v de glucosa añadida durante 10 min; línea marrón) y agotadas de glucosa (sin glucosa añadida durante 10 min; línea roja). b) igual que (a), pero para el 2,2% p/v de células fijadas con formaldehído. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. El monitoreo del estado traslacional de los ribosomas asociados con la traducción activa del ARNm utilizando sedimentación por gradiente de sacarosa (‘perfilado de polisomas’) es una técnica ampliamente aplicada26,27,28. En combinación con el análisis cuantitativo de microarrays y, másrecientemente,con la secuenciación de alto rendimiento28,44, el perfil de polisomas proporciona información sobre el transcriptoma de arNm asociado a ribosomas en todo el mundo. Con varias suposiciones, se ha argumentado tradicionalmente en el campo de la investigación de la biosíntesis de proteínas que la presencia polisomal es una indicación de participación activa en la traducción de los respectivos ARNm. Una conclusión adicional es a menudo (pero no siempre) justificada, que cuantos más ribosomas están presentes en un ARNm de una longitud dada (cuanto mayor es el orden de los polisomas), más activamente está involucrado el ARNm en la traducción. Por lo tanto, separar la fracción polisomal del resto del material puede ser útil desde el punto de vista de aislar el ARN traducido activamente. Dentro de los enfoques de perfil de huella, y particularmente TCP-seq10,38,39 que genera una población separada de las SSU liberadas derivadas de los complejos de codones de escaneo, inicio y parada, puede ser adicionalmente perspicaz eliminar las subunidades ribosómicas que no co-sedimentan con los monosomas o polisomas completos. Por lo tanto, hemos empleado la separación de los mRNP “no traducidos”, como las SSU libres (ARNm unido a una sola SSU o SSU sin ARNm adjunto) lejos del grupo de ARNm “que traducen activamente”. Para lograr esto, asumimos que los ARNm involucrados en las interacciones con uno (mono-) o varios ribosomas (polisomas) se pueden traducir activamente. Tales complejos pueden separarse de los demás por su mayor coeficiente de sedimentación. También sugerimos separar el grupo “traducido activamente” de ARNm en un cojín de sacarosa (50% p/v de sacarosa) en lugar de peletizar directamente el material en la pared del tubo. La centrifugación de los complejos de sedimentación rápida en el cojín nos permitió monitorear la separación utilizando la lectura del perfil de absorbancia y lograr una mayor producción del material solubilizado, no agregado y no desnaturalizado, en comparación con el peletizado y la resolubilización10,38. En general, para purificar las SSU individuales, los ribosomas, los disomes y los polisomas potencialmente compactados de un orden superior, los lisados clarificados fijos se sometieron a un proceso de ultracentrifugación de dos etapas(Figura 5). En el primer gradiente de sacarosa, la ultracentrifugación dio como resultado SSU libres separadas y LSU en la parte superior (10% -20% p/v de sacarosa) del gradiente, mientras que el grupo traducido reticulado que incluye polisomas y ARNm asociados con un ribosoma completo se concentró en la parte inferior (50% p/v de sacarosa) del gradiente (Figura 5a ). El 50% inferior p/v de la capa de sacarosa que contenía el grupo de ARNm traducido se concentró y su ARN se digirió con RNasa I, seguido de una segunda ultracentrifugación de gradiente de sacarosa para obtener disomas resistentes a la nucleasa (DS) separados para obtener SSU, LSU, RS, RNasa resistentes a la ARN y fracción menor de polisomas resistentes a la nucleasa de orden superior(Figura 5b). La tinción negativa con acetato de uranilo y la obtención de imágenes con un microscopio electrónico de transmisión confirmaron la identidad de los complejos aislados en cada etapa de sedimentación (Figura 5). Figura 5: Aislamiento del total de las fracciones de ARN traducido lejos del ARN no traducido. (a,c) Esquema (izquierda) y los respectivos resultados representativos (derecha; tipo de datos y trazado como se describe en la leyenda de la Figura 2) de (a) primera separación discontinua del gradiente de sacarosa de las fracciones de citosol no traducidas, incluidas las SSU libres y el pool de ARNm traducido identificado por cosedimentación con ribosomas y polisomas, y(c)separación de los complejos ribosómicos individuales liberados del pool de ARNm traducido por digestión controlada de RNasa I y ultracentrifugación a través de un segundo gradiente lineal de sacarosa en fracciones SSU, LSU, ribosómicas (RS) y disómicas resistentes a la nucleasa (DS). Se incluyeron cantidades altas (15 UA260) y bajas(8 UA 260)del material digerido no hambriento para demostrar la posibilidad de aumentar las cargas de ultracentrifugación cuando las fracciones menores son de interés. También se pueden identificar polisomas resistentes a las nucleasas de orden superior (por ejemplo, trisomas en los ejemplos proporcionados). b,d) Imágenes TEM representativas de fracciones contrastadas con acetato de uranilo de (a,c), respectivamente como están etiquetadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Con el fin de comprobar la idoneidad del régimen de fijación para la retención de proteínas transitorias asociadas a ribosomas (en particular, eIFs), probamos la co-sedimentación de eIF4A, un eIF lábil unido dinámicamente al ribosoma, a través de las fracciones ribosómicas. Aprovechamos la cepa de levadura marcada con eIF4A Tandem Affinity Purification (TAP) (TIF1-TAP) e investigamos la presencia de eIF4A en material derivado de las células fijas frente a las no fijas mediante el uso de anticuerpos anti-TAP, en comparación con la abundancia de Pab1p como un control adicional de unión al ARN, utilizando SDS-PAGE seguido de western blotting(Figura 6). Figura 6: Estabilización de proteínas transitorias en los complejos traslacionales sobre fijación de formaldehído in vivo. (a,b) (gráficos superiores) Lisado de células enteras (WCL) de(a ) no fijo y (b) 2,2% formaldehído fijo eIF4A-TAP células de levadura separadas por ultracentrifugación y visualizadas como se describe en la leyenda de la Figura 2. (gráficos inferiores) Imágenes de Western-blot de las respectivas fracciones de gradiente de sacarosa tras la separación del material analizado en los gradientes correspondientes (gráficos superiores), y WCL como control. c)Relación media entre la abundancia de eIF4A o Pab1p en las fracciones de material fijo y no fijo. Las proporciones relativas (normalizadas a la señal de todas las fracciones 2-7) de eIF4A (barras negras) y Pab1p (barras grises) se calcularon en 2,3 (SSU, LSU), 4,5 (RS, polisomas ligeros) y 6,7 (polisomas pesados) a partir de los datos de (a,b) (gráficos inferiores), y se tomó su relación fija a no fija. Las barras de error indican la desviación estándar de la relación con respecto a la media con las fracciones agrupadas (cuadros punteados) tratadas como réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Consistente con su alta abundancia en las células, observamos una alta intensidad de la señal de ambas proteínas en el lisado celular completo (WCL) y fracciones de sedimentación más lenta derivadas de células no fijas(Figura 6a,panel inferior). También hemos detectado cantidades sustanciales de estas proteínas en el WCL derivadas de las células fijas y tranquilizando la eficiencia de la extracción de material reticulado y la ausencia de pérdidas inesperadas(Figura 6b,panel inferior). Sin embargo, en contraste con las células no fijas, el material de las células fijas demostró una presencia relativa elevada de eIF4A en las fracciones ribosómicas de sedimentación más rápida, en comparación con Pab1p(Figura 6c). Este resultado sugiere que eIF4A permanece más firmemente asociado con los polisomas en el material reticulado con formaldehído. Habiendo confirmado el efecto de estabilización positivo y específico de la reticulación sobre la presencia de eIF4A en las fracciones ribosómicas, utilizamos el material fijo de la cepa de levadura marcada con eIF4A (TIF1-TAP) para capturar y enriquecer los complejos que contienen eIF4A mediante purificación de afinidad con perlas magnéticas de IgG. Tenemos fracciones WCL enriquecidas con afinidad, SSU libre y polisomal (piscina de ARNm traducida) después de la primera sedimentación a través del gradiente de sacarosa (por ejemplo, la sección 1.3 del protocolo de levadura), así como fracciones SSU, LSU y RS de la segunda sedimentación en el desmontaje de la piscina traducida en complejos individuales con RNasa I (por ejemplo, sección 1.4 del protocolo de levadura) (Figura 7 ). En todos los casos, a excepción de la fracción LSU, pudimos observar un enriquecimiento selectivo del eIF4A en las fracciones purificadas (eluido, E), en comparación con la presencia de β-actina en el material de origen (entrada, I) (Figura 7). Figura 7: Inmunopurificación selectiva de complejos traslacionales estabilizados con formaldehído in vivo mediante eIF4A asociado transitoriamente. El esquema ilustra la fuente de diferentes complejos traslacionales y epítopos eIF4A, incluido el WCL clarificado no fraccionado de las células de levadura eIF4A-TAP; SSU libres y pool de ARN traducido (polisomas) segregados en la primera ultracentrifugación; Fracciones SSU, LSU y RS liberadas del ARN traducido por digestión RNasa I y segregadas mediante segunda ultracentrifugación (ver texto). La imagen de Western blot proporciona una visualización de la abundancia de eIF4A en las fracciones en comparación con la abundancia de control de β-actina teñida simultáneamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Cuadro complementario 1. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

La fijación de formaldehído es un método conveniente y popular para lograr una reticulación rápida in vivo de biomoléculas^10,^36,^45,^46,^47,^48. En comparación con los otros objetivos potenciales de biomoléculas, la captura exitosa de complejos traslacionales requiere una fijación inmediata durante el enfriamiento por instantáneas de las células u otro material. Sin la estabilización no retardada, existe la posibilidad de que continúen los diferentes procesos relacionados con la traducción, desplazando la distribución compleja lejos del estado in vivo imperturbable⁴⁹. En comparación con los otros métodos de detención traslacional y estabilización del complejo ribosómico, la rapidez de la acción del formaldehído a través de las membranas celulares y la naturaleza indiscriminada de los enlaces cruzados prometen la preservación de la máxima diversidad de los intermedios complejos de traducción más cercanos a sus estados distribuidos nativamente⁵⁰.

El enfoque presentado aquí se ha establecido y optimizado tanto en células de levadura como de mamíferos, y otros grupos han derivado métodos para su uso en material biológico más diverso, como en vertebrados enteros (por ejemplo, embriones de pez cebra)¹⁰^,³⁸^,³⁹^,⁴⁹^,⁵¹^,⁵² . Aunque estos trabajos aseguran colectivamente la versatilidad y la amplia aplicabilidad del enfoque, la reticulación rápida de formaldehído de complejos traslacionales puede considerarse algo difícil de transponer a nuevos tipos de material biológico debido a la necesidad de optimizaciones y ajustes.

Un requisito principal para el éxito del método es la reoptimización de la concentración del formaldehído y la técnica de recolección y disrupción celular. Las células de levadura menos permeables, pequeñas y redondas requieren una concentración de formaldehído mucho mayor (al menos, 10 veces) y la interrupción física de las células fijas. Por el contrario, las células de mamíferos adherentes grandes y aplanadas en cultivo pueden fijarse en exceso fácilmente y requieren un manejo suave tras la fijación, mientras que la extracción de los complejos fijos se puede realizar químicamente con interrupción de la membrana utilizando detergentes. La reticulación insuficiente puede permitir que los intermedios menos estables o de vida más corta se disocien o se filtren a un estado posterior. El reticulamiento excesivo puede afectar negativamente la capacidad de aislar y estudiar fracciones ribosómicas y puede crear sesgos selectivos, como un agotamiento más profundo de complejos pesados. En nuestra observación, incluso alteraciones menores, como el tipo de células humanas adherentes utilizadas, pueden afectar el rendimiento de los complejos reticulados recuperados y pueden requerir una reoptimización del régimen de reticulación. También podemos anticipar que las células con propiedades de permeabilidad sustancialmente diferentes, como las células vegetales, requerirán una optimización extensa adicional de las condiciones de fijación⁵². Sin embargo, es difícil imaginar un tipo de material biológico que sea totalmente incompatible con el enfoque.

Una consideración pertinente al protocolo de fijación de mamíferos es la densidad y la cantidad de material celular utilizado como entrada. Se recomienda que las células crezcan continuamente sin volver a sembrar u otras perturbaciones durante al menos 2 días para evitar influencias externas en la dinámica de traducción celular. Aplicable para la mayoría de los tipos de células, pero para la mayoría de las células adherentes, los niveles de confluencia alcanzados consistentemente de no más del 70% asegurarán la ausencia de efectos importantes de inhibición del contacto que pueden afectar negativa e impredeciblemente las tasas de traducción.

Otra característica interesante, y potencialmente excepcionalmente conveniente, de la fijación de formaldehído derivada de su reactividad indiscriminada es el efecto de estabilización sobre los complejos traslacionales en sistemas de taxonomía mixta. Los complejos bacterianos, y aún más traslacionales de mitocondrias, cloroplastos y diferentes parásitos intracelulares, han sido notoriamente difíciles de atacar con inhibidores de traducción específicos. En contraste, en los datos TCP-seq, las huellas que se asignan al mitotranscriptoma son fácilmente observables en los datos³⁸^,³⁹^,⁵⁰. Un desarrollo posterior interesante podría ser el uso del enfoque para investigar la traducción en microcomunidades enteras, como en muestras de suelo, agua o intestino, donde la detención traslacional rápida confiable y la estabilización compleja con cualquier otro medio serían problemáticas.

También debe mencionarse que para el material más complicado (como tejidos duros y / o voluminosos), nada impide el uso de la estabilización de formaldehído inmediatamente después de la interrupción celular y la homogeneización del material. Este enfoque ya se emplea con frecuencia para eliminar el retraso de entrada celular al estabilizar complejos traslacionales con inhibidores específicos de moléculas pequeñas³³^,⁵³^,⁵⁴^,⁵⁵. Dado que la fijación de formaldehído se ha utilizado tradicionalmente con excelentes resultados para la estabilización de muestras ex vivo/in vitro en aplicaciones como la microscopía electrónica^45,^56,^57,^58,podemos esperar efectos aún menos negativos en este caso, particularmente aquellos asociados con la mala extracción de los complejos traslacionales de las células completamente fijadas.

Nuestros hallazgos confirman la usabilidad de la fijación rápida de formaldehído para estabilizar complejos altamente transitorios, como los que incluyen eIF4A. Cabe destacar que, a diferencia de los mamíferos, la levadura eIF4A se asocia mucho más débilmente con el complejo de unión a la tapa eIF4F y, como resultado, con los complejos traslacionales en general. eIF4A generalmente se pierde durante cualquier purificación extensa del material ribosómico en^{levaduras 29,}^59,^60,^61,^62,^63. Sin embargo, en el material de levadura fija in vivo,es posible lograr un enriquecimiento confiable de eIF4A en todas las fracciones de complejos traslacionales donde se anticiparía su presencia. Los datos de Sel-TCP-seq publicados anteriormente han demostrado el enriquecimiento de eIF2 y eIF3 que se asocian más fuertemente con los ribosomas (pero también revelaron un ensamblaje transitorio del complejo proteico co-traduccional)³⁹. Por lo tanto, el método es adecuado para la detección de constituyentes unidos más fuertes y débiles de los complejos traslacionales.

Para resumir, hemos presentado un enfoque útil para obtener información principalmente sobre los cambios que ocurren en la fase de inicio de la traducción y cuando se requiere una distribución ribosómica mínimamente perturbada sobre el ARNm. Es importante destacar que el enfoque es adecuado para la estabilización de componentes relativamente lábiles y dinámicos de complejos traslacionales, como eIF4A, y puede utilizarse ampliamente sujeto a las optimizaciones necesarias. También hemos proporcionado evidencia de la utilidad de la fijación de formaldehído en los escenarios de cambio dinámico rápido de la traducción, abriendo áreas de investigación como las respuestas celulares de ritmo rápido a los cambios ambientales o las condiciones de estrés.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la subvención del Proyecto de Descubrimiento del Consejo Australiano de Investigación (DP180100111 a T.P. y N.E.S), la Subvención para Investigadores del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (GNT1175388 a N.E.S.) y la Beca de Investigación (APP1135928 a T.P.). Los autores reconocen las instalaciones de Microscopy Australia en el Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad Nacional de Australia, una instalación financiada por la Universidad y el Gobierno Federal.

Materials

Yeast extract	Merck, Sigma-Aldrich	70161
Peptone	Merck, Sigma-Aldrich	70178
D-Glucose (Dextrose)	Merck, Sigma-Aldrich	49139
Adenine sulphate	Amresco	0607-50G
Formaldehyde solution	Merck Sigma-Aldrich	F11635-500ML	ACS reagent, 37 wt. % in H₂O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific	10777019
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	COEDTAF-RO Roche by Merck	11873580001
Magnesium chloride solution	(Merck/Sigma-Aldrich)	M1028
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	(Merck/Sigma-Aldrich)	E7889
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL	Ambion	AM2294
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL)	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific	AM2694
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0)	(Merck/Sigma-Aldrich)	P1944-100ML
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	11033
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	AM9740
Glycogen (5 mg/ml)	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific)	AM9510
Ethyl alcohol, Pure	Merck; Sigma Aldrich	E7023
Amersham^™ Hybond^® P Western blotting membranes, PVDF	Merck	GE10600023	PVDF membrane for western blotting
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	NW04120BOX	Protein gel
4X Bolt™ LDS Sample Buffer	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	B0007	LDS sample loading buffer
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards	BioRad	1610375	Protein ladder
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer	ThermoFischer Scientific	B0002	PAGE runninjg buffer
Intercept® (PBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-70001	Odyssey Blcoking buffer (PBS)
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	92632210
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	92632211
TAP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	CAB1001
Anti-beta Actin antibody	Abcam	ab8227
Sucrose	(Merck/Sigma-Aldrich)	84097	BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC)
DL-Dithiothreitol solution	(Merck/Sigma-Aldrich)	43816	BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H₂O
Terumo Syringe 1CC/mL	Terumo Syringe	878499
Potassium chloride	(Merck/Sigma-Aldrich)	60128
HEPES	(Merck/Sigma-Aldrich)	H3375
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	12003C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium	Sigma-Aldrich	D8662
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Tris hydrochloride	Merck/Sigma-Aldrich	10812846001
Sodium dodecyl sulfate	Merck/Sigma-Aldrich	436143
IGEPAL CA-630	Merck/Sigma-Aldrich	I3021
Rnasin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2111
Stainless steel grinding jar	Retsch	02.462.0059
MM400 mixer mill	Retsch	20.745.0001
Gradient Fractionator	Brandel	BRN-BR-188
Thermomixer R	Eppendorf	Z605271
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices	Eppendorf Safe-Lock	30121023
Mini Gel Tank	(Thermo Fisher Scientific)	A25977	PAGE running tank
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm	Beckman-Coulter	344057
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm – 50Pk	Beckman-Coulter	331372
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices	Merck	UFC5030	Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge	Cambridge Scientific	15566
Beckman Coulter Optima L-90K	GMI	8043-30-1191
Nunc EasYFlask 175cm2	Thermofisher Scientific	159910
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermofisher Scientific	14-432-22
25 mL Serological Pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1250
10 mL Serological Pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1100
DNA lobind tubes	Eppendorf	30108051
Cold Centrifuge 5810 R	Eppendorf	EP022628188	for 50 mL tubes
Orbital Shaking Incubator	Ratek	OM11
Frezco 17 Microcentrifuge	Thermofisher Scientific	75002402
Eppendorf DNA lo-bind tubes	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108051
Eppendorf® Protein LoBind tubes	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108116
SW 41 Ti Swinging bucket rotor	Beckman-Coulter	331362
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L	Thermofisher Scientific	51026282
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe	BD Medical	328822
3 mL syringe with Luer Lok tip	BD Medical	302113
25 G x 16 mm Hypodermic Needle	Terumo	TUAN2516R1

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In Vivo Fixation Translational Complexes Eukaryotic Cells Rapid Chilling Formaldehyde Fixation Glycine Quenching Cell Lysis Ribosomal Fractions Affinity Purification RNA Analysis Mass Spectrometry Yeast Culture Exponential Growth Phase Formaldehyde Concentration Fixation Time Cell Pelleting Glycine Buffer

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Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas