Visualização e Quantificação de TGFβ/BMP/SMAD Sinalizando em diferentes condições de estresse da tesoura de fluidos usando o ensaio de proximidade-ligação-assay

Proteínas dos fatores transformadores de crescimento beta (TGFβ) superfamília são citocinas pleiotrópicos com uma variedade de membros, incluindo TGFβs, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) e ^Activins1,2. A ligação ligante induz a formação de oligômeros receptores que levam à fosforilação e, assim, ativação do SMAD regulatório citomúmico (R-SMAD). Dependendo da subfamo de ligantes, diferentes R-SMADs são ^ativados1,2. Enquanto TGFβs e Activins induzem principalmente fosforilação de SMAD2/3, os BMPs induzem a fosforilação SMAD1/5/8. No entanto, há evidências acumuladas de que os BMPs e TGFβs/Activins também ativam R-SMADs da respectiva outra subfamo, em um processo denominado como ‘sinalização lateral’3,4,5,6,7,8 e que existem complexos SMAD mistos compostos por ambos, SMAD1/5 e SMAD2/3, ^membros3,9 . Dois R-SMADs ativados formam posteriormente complexos triméricos com o mediador comum SMAD4. Esses complexos de fator de transcrição são então capazes de translocar para o núcleo e regular a transcrição dos genes-alvo. Os SMADs podem interagir com uma variedade de diferentes co-ativadores e co-repressores transcricionais, levando à diversificação das possibilidades de regular ^genes-alvo10. A desregulamentação da sinalização SMAD tem sérias implicações em uma variedade de doenças. De acordo com isso, a sinalização TGFβ/BMP desequilibrada pode levar a patologias vasculares graves, como hipertensão arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditária ou aterosclerose3,11,12,13,14.

As células endoteliais (CE) formam a camada mais interna dos vasos sanguíneos e são, portanto, expostas ao estresse da cisalhamento (SS), uma força de atrito exercida pelo fluxo viscoso do sangue. Curiosamente, os CEs residentes nas partes da vasculatura, que são expostos a altos níveis de uniforme, laminar SS, são mantidos em um estado homeostático e quiescente. Em contraste, as CES que experimentam SS baixas e não uniformes, por exemplo, em bifurcações ou na menor curvatura do arco aórtico, são proliferativas e ativam vias ^{inflamatórias15}. Por sua vez, os locais de ECs disfuncionais são propensos a desenvolver aterosclerose. Curiosamente, os CES nessas áreas de atheroprone exibem níveis aberrantemente altos de SMAD2/3 ativados e SMAD1/516,17,18. Nesse contexto, verificou-se que a sinalização TGFβ/BMP aprimorada foi um evento inicial no desenvolvimento de lesões ateroscleróticas19 e a interferência na sinalização de BMP foi encontrada para reduzir significativamente a inflamação vascular, a formação de atheroma e calcificação ^associada20.

O Ensaio de Ligadura de Proximidade (PLA) é uma técnica bioquímica para estudar interações proteína-proteína em ^situ21,22. Ele se baseia na especificidade de anticorpos de diferentes espécies que podem ligar proteínas-alvo de interesse, permitindo detecção altamente específica de interações proteicas endógenas a um nível unicelular. Aqui, os anticorpos primários têm que se ligar ao seu epítope alvo a uma distância inferior a 40 nm para permitir a ^detecção23. Portanto, o PLA é muito benéfico em relação às abordagens tradicionais de co-imunoprecipitação, onde vários milhões de células são necessárias para detectar interações proteicas endógenas. No PLA, anticorpos secundários específicos da espécie, covalentemente ligados a fragmentos de DNA (denominados sondas Plus e Minus), ligam os anticorpos primários e se as proteínas de interesse interagirem, as sondas Plus e Minus se aproximam. O DNA é ligado na etapa seguinte e a amplificação do círculo de rolamento do DNA circular é possível. Durante a amplificação, oligonucleotídeos complementares rotulados fluorescente se ligam ao DNA sintetizado, permitindo que essas interações proteicas sejam visualizadas pela microscopia de fluorescência convencional.

O protocolo descrito aqui permite que os cientistas comparem quantitativamente o número de complexos ativos de transcrição SMAD em condições de SS atheroprotetor e atheroprone in vitro usando PLA. O SS é gerado através de um sistema de bomba pneumática programável que é capaz de gerar fluxo direcional laminar de níveis definidos e permite aumentos stepwise das taxas de fluxo. Este método permite a detecção de interações entre SMAD1/5 ou SMAD2/3 com SMAD4, bem como complexos mistos-R-SMAD. Ele pode ser facilmente expandido para analisar interações de SMADs com co-reguladores transcricionais ou para complexos de fatores de transcrição que não sejam SMADs. A Figura 1 mostra os principais passos do protocolo apresentado abaixo.

Figura 1: Representação esquemática do protocolo descrito. (A) As células semeadas em slides de 6 canais são expostas ao estresse da cisalhamento com um sistema de bomba pneumática. (B) As células fixas são utilizadas para o experimento PLA ou para condições de controle. (C) As imagens dos experimentos pla são adquiridas com um microscópio de fluorescência e são analisadas por meio do software de análise ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.