单边坐骨神经粉碎损伤后大鼠运动行为的多因素评估

所有动物实验均得到德国维尔茨堡市雷吉隆冯·翁特弗兰肯地方当局的批准，并根据适用的国际、国家和/或机构动物护理和使用准则进行。 1. 坐骨神经粉碎损伤 注意：在整个外科手术过程中保持无菌环境。设置手术台，配备必要的设备。 在封闭的柜子里对老鼠进行深度麻醉，O2（2 L/min）中异氟烷为3.0%。把老鼠从柜子里移开。剃掉右后肢的大片区域。 将大鼠放入麻醉面膜中，在 O 2（2 L/min）中使用异氟素2.0% 继续深麻醉。通过捏捏后脚的双子间织物来控制麻醉深度。缺乏戒断反射表明麻醉充分。 用胶带修复大鼠的躯干和两个后肢。将爪子平放在手术台上，将后肢置于对称和伸出的位置。 在眼睛上涂上眼药膏，防止眼睛干燥。用防腐剂对剃光区域的皮肤进行消毒。 寻找硅的坐骨架。 用手术刀将皮肤切口从坐骨切入爪子的方向。皮肤切口应尽可能小（约1至2厘米）。 如果后肢固定且皮肤切口正确，则可以看到臀部最大肌肉和二头肌股骨肌肉之间的筋膜平面腔类似于”白线”。将封闭的超细止血钳（5号）插入腔中，并展开钳子。面部平面应打开，而不会伤害任何肌肉组织。 将橡皮筋缩回器放在肌肉下方，以保持皮肤切口打开。 轻轻地从坐骨神经中去除周围的组织和血管，直到神经完全暴露。在整个过程中，不要伸展或拉神经是很重要的。 用无锯齿夹（超细血压）粉碎坐骨神经，具有恒定且可重复的压力。为此，打开夹子，将神经放在夹子的下颚上，并通过将其锁定到第一位置十秒钟来关闭夹子。坐骨神经粉碎的位置位于靠近坐骨神经缺口的位置，靠近主坐骨神经束的分裂部位。粉碎受伤后，小心地重新打开夹子。坐骨神经的粉碎部位看起来是半透明的。 取出橡皮筋缩车。 用可重新溶性的 4 -0 缝合关闭时尚平面切口。用身体皮肤主食关闭皮肤切口。 根据 GV-SOLAS 指南（5 毫克/千克体重，皮下注射）应用 Rimadyl，在手术后两天内每 24 小时进行一次术后止痛。 将鼠从手术设置中取出。将大鼠放入一个干净的笼子里，在加热板（37 °C）上没有床上用品，直到老鼠清醒。把老鼠移回干净的家笼子里。 手术后四到六天取出身体皮肤钉。 2. 开放式现场测试（OFT） 注：LOC运动活动以及行为活动可以通过 OFT 进行分析。 设置 在黑暗而安静的环境中设置 OFT （图 1A）。它由自动视频跟踪系统 EthoVision XT（计算机、带许可证的软件）和具有防划痕、可清洁的黑色表面的 58.5 厘米（长度）x 58.5 厘米（宽）x 45 厘米（高度）的竞技场组成。黑色表面在跟踪白色动物时必须增加对比度。 评估 将竞技场和摄像机置于正确的位置。调整摄像机，记录整个开放领域框的最佳分辨率。在黑暗的环境中进行实验。如果设置需要光线，请使用小而分散的光线来避免竞技场上的光点、反射和阴影。通过测量竞技场不同区域的 lux 仪表的照明，确保光线条件相等。 设置电子视网XT软件。最重要的设置列在以下环境中。在实验设置中，选择视频源的实时跟踪和跟踪功能的中心点检测。验证竞技场设置中的竞技场大小。将数据采集的起始条件设置为将大鼠放入竞技场中间后的三秒钟，在试用控制设置中将总运行时间设置为 5 分钟。在检测设置中选择静态减法。检查标记 在获取设置中保存方法的视频。 将鼠轻轻地放在测试竞技场中间（图1B）。 按下收购控制中的”开始试用”按钮开始录制。 在录制过程中，远离 OFT 设置，以避免分散鼠的注意力。 每次试验后，将大鼠轻轻地从试验场中取出，用 0.1% 的醋酸清洁设置，以避免被先前记录的老鼠的气味分心。 数据分析 有关使用 EthoVision XT 软件对 OFT 的数据分析，请转到左侧栏中的分析部分，并在结果选项卡（图 1C）下选择跟踪可视化。接下来，将所需的参数导出到 Excel。在软件中，从不同类别中选择多个变量进行数据分析。这一特定科学目标的重要变量是”距离移动”和”速度”类别下的”距离和时间”。对选定的参数（图 1D）进行统计分析。 3. 猫步 XT 步态分析 注：通过CatWalk XT系统进行步态分析有助于评估有关动物模型脚印、姿势和步态的许多不同参数。玻璃走道用绿灯照明，用位于走道下方的高速摄像机捕捉动物脚印散射的光线。这些信号可以通过猫步 XT 软件进行分析。 设置 有关 CatWalk XT 的步态分析，请使用 CatWalk 系统和相应的软件（计算机、带许可证的软件）（图 2A）。 在黑暗条件下进行实验，因为数据采集取决于带绿色 LED 灯的 CatWalk 系统走道的照明。为了方便在黑暗条件下进行实验，用红灯照亮实验室。 使用长度为 65 厘米、宽度为 7 厘米的定义走道;然而，走道的大小取决于老鼠的大小。设置尽可能大的人行道，为每只爪子记录尽可能多的脚印。 每次跑步每爪至少捕获三个脚印。在定义走道长度时，考虑大鼠的身体和尾部，因为启动或停止信号可能检测不正确，如果身体/尾部在运行完成前或运行后进入或停留在定义的走道上，则运行可能不属于合规状态。 训练注意：训练老鼠的CatWalk系统是必要的，以习惯动物的设置，并允许他们学会通过走道没有任何中断。适当的培训提供了在实验评估期间节省时间和取得更好结果的优点。在培训期间开始获取 CatWalk 系统的数据，使大鼠能够习惯评估条件（噪音/光线）。开始设置猫步系统。 用蒸馏水和无绒软布清洁玻璃走道。在实验的开始和结束时，或在玻璃走道脏污之间，使用玻璃清洁液和无绒软布清洁玻璃走道。使用玻璃清洁液后，清除液体残留物的走道，避免分散动物的注意力。 选择实验设置。一个重要的参数是 运行标准。为 要获取的最小运行持续时间、 最大运行持续时间和 最小合规运行次数设置适当的值，这些值适用于每个研究项目。勾选” 使用最大允许速度变化 “框并设置值。在头四到五天的训练中， 跑步标准 可以忽略。 将摄像机放置在原位并调整对焦。找到最佳的摄像头位置，以同时实现人行道的适当长度和记录爪的最佳分辨率。在 CatWalk 系统上标记相机位置，以确保摄像机在录制之间放置相同位置。 使用自动检测进行新实验来设置检测设置。确保所有脚印都能以最小的背景噪音检测到。如有必要，手动优化检测设置并更改绿色强度阈值。在整个实验中使用相同的检测设置。 设置猫步系统的走廊墙壁。走廊的墙壁应该尽可能靠近老鼠。确保走廊墙壁与走道保持平行。 定义走道的长度：单击 定义走道 图标。根据具体的研究项目，调整白色矩形的长度和宽度。单击 “确定”。 校准走道：单击 校准走道 图标。将长方形校准表放置在走道中间 20 x 10 厘米处。将白色矩形的大小调整到校准表。单击 “确定”。 接下来，捕捉背景图像：事先检查走道是否干净和空。单击 “快照后台 “按钮生成背景图像。 在开始实际实验之前，训练动物至少八天。建议连续几天进行培训。 训练的第一天：为了让老鼠习惯猫步系统，让动物自由探索走道和目标箱。让老鼠练习穿过走道，进入球门框。在走道的尽头或球门箱里捡起老鼠，把老鼠带回走道的起点。建议在培训的第一天进行五次跑步，而无需遵守实验设置。 训练的第2天：老鼠可以自由探索走道和球门框。建议在不遵守实验设置的情况下运行五次。 培训的第 3 天：建议在不遵守实验设置的情况下进行 8 次跑步。 培训的第 4 天：建议在不遵守实验设置的情况下进行 10 次跑步。 培训的第5天：建议进行10次跑步。实验设置应记住。激励老鼠在不间断的情况下穿过走道。 培训的第 6 天：建议进行 10 次跑步。实验设置应记住。激励老鼠在不间断的情况下穿过走道。 培训的第 7 天：建议进行 10 次跑步。应至少实现三次合规运行。如果动物无法达到这个目标，则为它们添加更多的跑步。 培训的第 8 天：建议进行 10 次跑步。应至少实现三次合规运行。如果动物无法达到这个目标，则为它们添加更多的跑步。 评估 根据定义的运行标准，为数据分析，每只大鼠执行三次符合要求的运行。有关评估，请按照步骤 3.2.1 进行。- 3.2.1.8.如培训部分所述。即使大鼠在前三次跑步中达到三次符合要求的跑步，也为了训练目的，每周至少进行六次跑步。 执行至少一个（训练）课程，每周运行六次，以获得稳定的步态模式，用于具有多个时间点的实验。整个实验的实验和检测设置保持一致。 数据分析 对于数据分析，仅评估合规运行。删除不符合要求的运行。 如有必要，在爪印分类之前，验证绿色强度阈值并增加或降低绿色强度阈值。对于所有动物和所有跑步，绿色强度阈值必须一致。 使用猫步 XT 软件（图 2B）自动对爪子打印进行分类。 手动查看爪子打印标签。纠正错误的爪印标签，添加未检测到的爪印标签，并手动删除噪音和错误标签。将视频移动到必须手动查看的位置。要更正错误的标记爪印，请选择特定爪印的矩形，单击 “重置”，再次选择相同的矩形，并从列表中分配正确的标签。对于未检测到的爪印进行标记，请在未检测到的爪子周围绘制一个矩形，单击 “添加打印”，选择新生成的矩形，并从列表中分配正确的标签。如果软件自动标记鼻子或身体打印，选择特定标签的矩形，然后单击 “删除打印”。 查看数字结果。数字结果显示在卓越表中，显示一些基本参数。根据研究兴趣选择预先定义的特定参数，并照常进行统计分析（图 2D）。 有关每个脚印的更详细信息，可以对后爪的脚趾进行分类。此分析需要 交互式足迹测量 模块。 如有必要，请调整 绿色强度阈值 ，以进行 交互式足迹测量 分析。对于所有动物和所有跑步， 绿色强度阈值 必须一致。 手动设置足迹分析的标记。分析所有三个合规运行中的每一个后爪打印。从第一个脚趾的中心到第五个脚趾的中心画一条线来测量”脚趾扩散”。从第二个脚趾的中心到第四个脚趾的中心画一条线来测量”中间脚趾扩散”。从第三个脚趾的中心到后爪的脚跟画一条线来测量”手动打印长度”（图2C）。 查看单独表中显示的”交互式足迹测量”的数字结果。选择”交互式足迹测量”的特定参数，并照常进行统计分析（图 2E）。 4. 光束行走任务 注：盖特赤字可以通过光束行走任务来确定。在这个特定的研究课题中，光束行走任务的重点将是运动协调的分析，定义为协调多个身体部位肌肉激活的能力，而不是运动平衡的评估，定义为身体运动期间的姿势控制能力。 设置 对于光束行走任务，使用光束、隔间、桌子、统一背景和摄像机（图3A）。 使用长90厘米、宽1.7厘米、高2厘米的木梁。建议在梁的两端采用长20.5厘米、宽15厘米、高2厘米的平台。对平台和光束使用相同的材料，避免平台和光束之间的任何障碍。 光束和桌子之间的距离至少为 44 厘米。熟悉的环境，如家庭笼子，促使老鼠穿过横梁，可以放置在光束平台的末端。 训练 设置横梁，桌上有垫片和家庭笼。 训练动物七天。建议连续几天进行培训。 培训的第一天 将所有老鼠从一个家庭笼子放在横梁的启动平台上。 让老鼠探索环境（平台/光束）。 小心地抓住一只老鼠的尾巴，把老鼠轻轻推到横梁上，把老鼠引向横梁。 协助老鼠穿过横梁，用尾巴抱住老鼠至少两次。 让老鼠在没有帮助的情况下再穿过横梁三次。观察老鼠，并在必要时提供帮助。如果大鼠未能穿过横梁，则拦截坠落，以避免伤害和恐惧的发展，以穿过横梁。 继续为所有大鼠进行此程序。注意：有时老鼠互相跟踪穿过光束，在这种情况下不需要任何帮助。然而，观察老鼠、拦截瀑布以及必要时提供帮助是很重要的。 培训的第2天 将所有老鼠从一个家庭笼子放在横梁的启动平台上。 让老鼠穿过横梁六次。 如有必要，提供协助并拦截坠落。 培训的第3天 将一只老鼠放在光束的启动平台上。 让老鼠穿过横梁六次。 如有必要，提供协助并拦截坠落。 培训的第4-7天 将一只老鼠放在光束的启动平台上。 让老鼠穿过横梁十次。 如有必要，提供协助并拦截坠落。 训练结束时，老鼠应该在至少三次跑步中不间断地穿过横梁。允许将鼠轻轻推上启动平台，以触发运动启动。 评估 设置横梁，桌上有垫片和家庭笼。 将摄像机放在位置，与对焦的动物平行于光束对齐。摄像机的位置应尽可能靠近动物，以实现记录运动的最佳分辨率。光束和两个平台的部件应通过录制捕获。 开始录制，并首先识别会话和动物。 将鼠放在光束的启动平台上。 老鼠应该毫不间断地穿过横梁三次。即使大鼠在前三次运行中达到三次合规运行，也至少进行六到十次运行以执行连续任务。 如有必要，请始终观察动物并拦截坠落。 任务完成后，用0.1%的醋酸清洁横梁和桌子，以避免被先前记录的老鼠的气味分心。注：在神经粉碎损伤后的头两周内，没有帮助，老鼠无法穿过横梁。因此，在神经粉碎损伤后的头两周内，必须提供六到八次跑步的帮助。从第三周到第五周，在协助下进行五次跑步，在没有协助的情况下再进行十次跑步。 数据分析 使用免费的视频分析软件基诺韦亚进行数据分析。 从录制中选择三个合规运行的视频序列。为此，选择在动物没有帮助的情况下执行的前三个合规运行。在所有大鼠的合规运行选择中保持一致。 定义所选三个合规运行的开始时间点和结束时间点（图3D-E）。在此设置中，起点由光束上的一条黑线标记，黑线后面的第一个后肢的位置定义了运行的开始时间点。在光束末端平台上放置第一个后肢定义了结束时间点。 接下来，计算老鼠穿过光束所需的时间。报告数据为延迟时间，在几秒钟内穿过光束，并照常进行统计分析（图3B）。 使用软件的缩放和慢动作功能，分别对两个后肢三个合规运行的步骤和错误数进行评分。错误包括总脚滑和半脚滑。总脚滑被定义为脚的位置，然后是深滑，导致受影响的爪子与光束失去联系（图3F）。半滑动被定义为爪子滑出光束的侧壁，而不会与光束完全接触（图3G）。 根据穿过横梁的步数计算脚滑的百分比（（肢体的脚滑次数 x 100%）/同一肢体的步数）。以百分比脚滑动为比例提供数据，并照常进行统计分析（图3C）。 5. 梯级行走任务 注：梯级行走任务可以评估运动功能、前肢和后肢的放置以及间肢协调。 设置 使用梯级设备、垫片、桌子、统一背景和摄像机进行此行为测试（图 4A）。水平梯级装置由金属梯级和透明聚碳酸酯侧壁组成。该装置的长度为119.5厘米，宽度调整为7.4厘米。要分析的人行道长度为 100 厘米。 在侧壁上用黑线标记开始和结束点。以 1 厘米的间隔放置设备梯级的占位符。为 100 厘米的走道安排梯级的不规则模式，梯级之间的距离为 1 到 5 厘米。最初 10 厘米的开头和末端的最后 9.5 厘米（不包括分析）具有 1 厘米的梯级的常规模式。 使用走道和约30厘米（图4A-B）之间的距离。目标箱或设备末端熟悉的环境，如家庭笼子，会激励大鼠穿过梯级装置。 训练 设置梯级装置，桌上有垫片和目标箱。 训练动物八天。建议连续几天进行培训。 培训的第一天 将家里笼子里所有的老鼠放在梯子梯级装置上。 让老鼠探索环境（梯级设备/目标箱）。 轻轻地把老鼠推到目标框的方向。协助老鼠进入球门框。让老鼠探索一下目标框。 毕竟老鼠都进了球门框。将第一只老鼠从球门框中取出，将鼠再次放在仪器的启动区域。继续对一个家庭笼子里的所有老鼠进行同样的程序。如果需要，轻轻地将老鼠推入球门框的方向，并协助进入目标框。 让老鼠穿过仪器四次。 培训的第2天 执行与培训第一天列出的相同的协议。 让老鼠穿过仪器六次。 培训的第3天 执行与培训第一天列出的相同的协议。 让老鼠穿过仪器八次。 培训的第4天 将一只老鼠放在梯级装置的启动处。 如果大鼠不穿过仪器，自愿进入目标框，请从后面轻轻推鼠，给予帮助。 让老鼠穿过仪器八次。 培训的第5-8天 将一只老鼠放在梯级装置的启动处。 如果大鼠不穿过仪器，自愿进入目标框，请从后面轻轻推鼠，给予帮助。 让老鼠穿过仪器十次。 训练结束时，老鼠应该能够在没有任何干扰和协助的情况下穿过走道，至少跑三圈。允许在启动区轻轻推击大鼠以触发运动启动。 评估 设置梯级装置，桌上有垫片和目标箱。 将摄像机放在位置，与与动物对焦的仪器平行对齐。将摄像机定位到尽可能靠近动物的位置，以实现记录动作的最佳分辨率，并确保在记录中捕获整个梯级设备。 开始录制，并首先识别会话和动物。 将鼠放在梯级装置的启动区域。 老鼠必须三次不间断地穿过梯级设备的100厘米走道，才能符合标准运行。即使大鼠在前三次运行中达到三次合规运行，也应至少进行十次运行以执行连续任务。 任务完成后，用0.1%的醋酸清洁仪器和桌子，以避免被先前记录的老鼠的气味分心。 数据分析 使用免费的视频分析软件基诺韦亚进行数据分析。 从录制中选择三个合规运行的视频序列。选择前三个符合要求的运行进行数据分析。 定义所选三个合规运行的开始时间点和结束时间点。将第一个后肢放置在设备侧壁上的第一条黑线后面，该黑线标记了 100 厘米人行道的起点，定义了运行的开始时间点。将第一个前肢放置在第二条黑线后面，放在设备侧壁上，标记 100 厘米走道的终点，从而定义运行的结束时间点。 确定开始和结束时间点。接下来，计算穿过走道的运行时间。报告数据为延迟时间，在几秒钟内穿过走道，并照常进行统计分析（图4C）。 使用软件的慢动作或软件（图 5）16、17的逐帧功能，根据 Metz等人的 7 类比例对三个符合要求的运行进行评分。根据每个肢体的分级类别分别确定步骤数和错误数。比例区分以下类别：（0） 总错过 （1） 深滑 （2） 轻微滑 （3） 替换 （4） 更正 （5） 部分放置，和 （6） 正确放置。只有启动肢体的错误被评定。不应对初始错误触发的进一步错误进行评级。 考虑以下要求来计算错误/步骤。类别 （0） 总错过 （1） 深滑 （2） 轻微滑倒算作错误。将错误数除以每个后肢的步骤数和每个后肢的步骤数。分别确定每只动物和每只后肢所有三种合规运行的平均值，并照常进行统计分析（图4D）。