D11 scFv-알칼리성 포스파타제 융합 단백질 및 면역형광을 이용한 조직 내 이솔레부글란딘의 직접 검출

밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 이 원고에 설명된 모든 절차를 승인했습니다. 마우스는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 사육되고 관리됩니다. 모든 피험자는 Vanderbilt University의 Institutional Review Board의 승인에 따라 연구에 등록하기 전에 서면 동의서를 제공했습니다. 모든 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 1. D11-알칼리성 포스파타제 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 및 음성 대조군 벡터의 제조 단일 사슬 단편 변수(scFv) 세그먼트가 3′ 말단에서 박테리아 알칼리성 포스파타제(AP)를 암호화하는 서열에 연결된 pCANTAB5E 플라스미드13,14의 변형된 버전을 구성합니다.참고: scFv 서열의 NotI 제한 부위의 바로 하류에서 변형된 플라스미드는 더 이상 E-태그의 코딩 서열을 포함하지 않고 대신 링커 서열 GGSGGHMGSGG를 인코딩한 다음 AP에 대한 서열을 인코딩합니다(GenBank 수탁 번호 AXY87039.1, T16-K464)15,16. AP의 다운스트림에서 플라스미드는 8xHis 및 DYKDDDDK 태그를 인코딩합니다. 태그의 3′ 끝에서 코딩 시퀀스는 황색 정지 코돈으로 끝납니다. 변형된 플라스미드를 pCANTAB5-AP라고 합니다. SfiI/NotI 제한 사이트를 사용하여 D11 scFv(GenBank 수탁 번호 AAW28931.1)를 pCANTAB5-AP에 복제합니다. SfiI/NotI 제한 사이트를 사용하여 D20 scFv를 pCANTAB5-AP로 복제합니다.참고: D20 scFv는 관련 없는 scFv의 조직 상호작용 패턴을 평가하도록 설계된 음성 대조군입니다. 이 scFv는 원래 A2로 알려진 글리칸 그룹과 상호 작용하는 능력 때문에 파지 디스플레이에 의해 선택되었습니다. 플라스미드에서 scFv 부분을 완전히 제거하고 이를 아미노산 GGGGSGRAGSGGGGS로 구성된 “AP 링커” 코딩 서열로 대체하여 “빈” 벡터를 생성합니다. 모든 플라스미드를 적격한 TG1 E. coli 로 변환하고 100μg/mL 암피실린과 2% 포도당(2xYTAG) 배지가 보충된 2xYT가 포함된 0.5% 한천 플레이트에서 30°C에서 밤새 박테리아를 성장시킵니다.참고: supE 유전자를 가진 균주(예: TG1 E. coli)는 호박색 정지 코돈을 100% 억제하지 않습니다. 추정치는 0.8 – 20%의 시간 범위이므로, BAP의 바로 다운스트림에서 종료되는 생성물이 여전히 많이 존재한다17. TG1 대장균 은 주로 시간과 비용의 절감, pCANTAB 단백질 발현 시스템과의 호환성, 실험실에서 일반적으로 수행되는 파지 디스플레이에서의 사용과 같은 실용적인 이유로 사용됩니다. BAP에 이어 호박 정지 코돈의 하류는 geneIII에 대한 서열이다. scFv-geneIII 융합 단백질이 특정 유전자III 단백질을 방해하여 나이브 박테리아를 재감염시키기 때문에 GeneIII 융합 단백질은 파지 디스플레이가 의도한 대로 기능하기 위해 드물게 발현되어야 합니다. 그러므로, 융합이 없는 유전자III 단백질은 기능성 파지의 생성을 위해 비리온 조립 동안 존재할 필요가 있다, 즉, scFv-유전자III 단백질 생성물은 일반적으로 박테리아 내에서 비교적 드물다. D11-AP, D20-AP, 빈 벡터, 및 본 논문에 사용된 모든 구축물은 모두 간헐적인 geneIII 융합 단백질 발현에 의해 유사하게 영향을 받는다. 이러한 단백질이 어떻게 작용하는지에는 여전히 관찰된 차이가 있습니다. 개별 콜로니를 선택하고 신선한 5mL의 2xYTAG 배양액을 접종합니다. 박테리아가 30°C에서 밤새 자라도록 하고 150rpm에서 진탕합니다. 실온에서 10분 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 상청액을 버리고 펠릿을 85% 2xYTAG 및 15% 글리세롤 2mL에 재현탁합니다. 글리세롤 스톡을 -80°C 냉동고에 보관하십시오. 2. 주변 세포질 추출물의 단백질 발현 및 생성 참고: 주변세포질 추출물의 생성은 파지 디스플레이에서 단백질 발현에 일반적으로 사용되는 방법이며, 이는 주로 이황화 결합의 형성이 scFv 및 항체 생성에 중요하기 때문입니다. 이 방법은 용해물(일반적으로 봉입체 포함)을 생성할 필요가 없고 단백질이 적절하게 접히도록 합니다. pCANTAB은 D11-BAP 융합 단백질의 scFv 부분의 상류에 있는 gIII 신호 서열을 갖는다. 신호 서열은 단백질이 박테리아의 주변 세포질 공간으로 셔틀된 다음 신호 서열이 절단되도록 합니다. 주변 세포질 공간은 산화 환경을 제공하며, 이는 이황화 다리의 적절한 형성에 중요합니다. 삼투압 쇼크는 박테리아를 온전하게 유지하면서 주변 세포질 단백질을 주변 배지로 방출할 수 있을 만큼 외막을 파괴하기 때문에 주변 세포질 추출물을 유도하는 데 사용됩니다. 관련 플라스미드를 함유하는 대장균 글리세롤 스톡을 2xYTAG의 60 mL 배양물에 접종하고, 150 rpm에서 진탕하면서 30°C에서 밤새 배양한다. 단백질 발현을 유도하기 위해, 펠렛 박테리아 배양을 3,000 x g 에서 10분 동안 하고, 60 mL의 2xYTA 배지에 재현탁하고, 150 rpm에서 진탕하면서 30°C에서 밤새 배양한다.참고: 2xTYAG에서 2xYTA 배지로의 전환은 단백질 발현의 충분한 유도에 도움이 된다18. 포도당이 박테리아 배지에 존재할 때, 포도당이 처리하는 데 더 적은 에너지를 소비하기 때문에 박테리아가 우선적으로 포도당을 소비하고 유당을 무시하기 때문에 lac 프로모터가 억제됩니다. 배지 전환 후 포도당이 제거되면 박테리아는 2xYT 배지에서 제공하는 탄수화물에 의존합니다. 효모 추출물(2xYT의 Y 성분)은 유당을 포함한 탄수화물을 함유하고 있으므로 lac 프로모터를 통해 단백질 발현을 유도할 수 있습니다. IPTG는 pCANTAB 구조와 함께 필요하지 않으며 비기능성 단백질을 초래하는 봉입체와 함께 과도한 단백질 발현을 초래할 수 있습니다. 삼투압 충격을 통해 주변 세포질 추출물을 생성합니다.펠렛 박테리아 배양을 3,000 x g 에서 10분 동안 배양합니다. 20mL의 1xTES(0.2M Tris-HCl pH 8.0, 0.5M EDTA, 0.5M 자당)에 재현탁하고 얼음에서 1시간 동안 배양합니다. 다시 3,000 x g 에서 10분 동안 펠렛화하고, 0.05 M Tris, pH 7.6의 15 mL에 재현탁시킨다. 이 현탁액을 얼음에서 1시간 동안 배양한 다음 5,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 정화합니다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 정제 또는 실험에 직접 사용하기 위해 필요할 때까지 -20°C에서 보관합니다. ELISA에서 활성 D11-BAP의 존재에 의해 세포 용해를 평가합니다. 주변 세포질 추출물 3-5 μL를 pNPP 1mL에 넣은 다음 다음 10 분 동안 색 변화가 일어나는지 관찰하십시오 (색이 맑은 노란색에서 강렬한 노란색으로 변함).참고: 색상은 용해물을 받지 않은 pNPP 튜브 또는 나이브 TG1 박테리아의 용해물을 받은 pNPP 튜브와 나란히 비교할 수 있습니다. 405nm에서 흡광도로 정량합니다. 4. ELISA에서 D11-AP 역가의 특성화 5μg/mL의 마우스 혈청 알부민(MSA)(음성 대조군) 또는 5μg/mL의 IsoLG/MSA(양성 대조군)를 포함하는 25μL/웰 인산염 완충 식염수(PBS)(1.8mM KH2PO4, 10mMNa2HPO4, 2.7mM KCl, 137mM NaCl)로 4°C에서 밤새 384웰 폴리스티렌 플레이트를 코팅합니다. 접시를 비우고 두드려 말리십시오. PBS + 0.1% 트윈(PBS-T)으로 한 번 세척합니다. 접시를 비우고 두드려 말리십시오. 블로킹 완충액(120μL/웰)으로 플레이트를 PBS-T로 채웁니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 접시를 비우고 두드려 말리십시오. D11-AP 주변세포질 추출물을 25μL/웰에서 연속 1:2 희석하여 PBS-T에 희석합니다. 음성 대조군으로 PBS-T만 포함하는 하나의 웰을 포함합니다.참고: 주변세포질 추출물의 일반적인 희석 범위는 1:8 – 1:4096입니다. 25 μL 분석 부피의 경우, 시작 “1:8” 농도 50 μL(주변 세포질 추출물 6.25 μL 및 PBS-T 43.75 μL)로 시작합니다. 그런 다음 이 용액 25μL를 제거하고 PBS-T 25μL가 들어 있는 다음 웰에 추가하여 2배 희석을 수행하고 위아래로 피펫팅합니다. 이 우물에는 이제 “1:16” 희석이 포함되어 있습니다. 2배 희석을 계속 반복하여 설명된 1:2 희석 시리즈를 생성합니다. 실온에서 1.5 시간 동안 배양하십시오. 접시를 비우고 두드려 말리십시오. PBS-T로 5번 세탁합니다. 비우고 두드려 말리십시오. 1 L의 930 mM 디에탄올아민 (H2O중 1:10으로 희석된 98% 원액)에 pNPP 1 g을 0.5 mMMgCl2 로 용해시키고 HCl로 pH 9.5로 조정하여 pNPP 용액을 제조한다. 25μL/웰 pNPP 용액을 적용하여 AP를 개발합니다. 실온에서 1시간 동안 배양하고 호환 가능한 플레이트 리더를 사용하여 각 웰 내에서 405nm에서 흡광도를 측정합니다. IsoLG/MSA 웰에서 생성된 신호를 MSA 웰에서 발생하는 노이즈와 비교하여 신호가 노이즈보다 5배 이상 높은 희석 범위를 찾습니다. 이 D11-AP 신호 희석 계열을 그래프에 표시하고, 곡선의 선형 범위를 결정하고, 신호의 50%를 관찰할 수 있는 희석을 설정합니다.참고: 이 희석액이 약 1:1,000에 해당하는 경우 D11-AP 용액을 IHC/IF에서 1:10 농도로 사용할 수 있습니다. 5. 면역형광 마이크로톰을 사용하여 마우스 및 인간 파라핀 포매 조직(5μm 두께)의 연속 절편을 절단하고 온수 수조(37°C)에 넣습니다. 유리 슬라이드에 조직 섹션을 장착하고 밤새 건조시킵니다.참고: 이 연구를 위해 대동맥은 생쥐에서 얻었습니다. 정상 혈압 및 고혈압 인간의 결장 절편은 Vanderbilt Cooperative Human Tissue Network에서 얻었습니다. 슬라이드를 자일렌에 5분 동안 세 번 담가 조직을 탈파라핀화합니다. 조직을H2O중 95%, 70% 및 50% 에탄올로 각각 2회 세척하여 재수화한다. 슬라이드 홀더에 TBST를 채운 다음 TBST를 폐기하여 0.1% Tween20(TBST)이 포함된 Tris-buffered saline(TBS)으로 슬라이드를 세 번 빠르게 세척합니다.참고: 수화된 슬라이드는 항원 회수 전 일주일 이상 4°C에서 TBST에 보관할 수 있습니다. 슬라이드의 열 유도 항원 검색을 수행하려면 예열된(80-95°C) 구연산 나트륨 완충액(10mM 구연산 나트륨, 0.05% 트윈 20, pH 6.0)에 슬라이드를 넣고 총 항원 검색 시간 20분 동안 고압에서 4분으로 설정된 압력솥에서 배양합니다. 압력솥에서 슬라이드를 제거하고 실온에서 20분 동안 식힙니다. 빠른 세척으로 TBST에서 슬라이드를 세 번 세척하십시오.참고: 슬라이드는 항원 회수 후 염색 전 일주일 이상 TBST에 보관할 수 있습니다. TBST에 용해된 2% BSA를 추가하여 슬라이드를 차단합니다. 슬라이드를 파라핀 필름 스트립으로 덮고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 슬라이드에서 차단 버퍼를 삭제합니다. TBST에 200μL의 1:10 D11-AP를 슬라이드에 추가하고 파라핀 필름 스트립으로 덮습니다. 실온에서 3시간 동안 항체 용액 증발을 최소화하기 위해 가습된 챔버에서 배양합니다. TBST에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오. 각각 면역조직화학 또는 면역형광을 위한 비색 또는 형광 알칼리성 포스파타제 현상액으로 개발합니다. TBST로 슬라이드를 한 번 세척하여 과도한 현상액을 제거하고 추가 발색을 방지합니다. 면역형광을 위해 PBS에서 1μg/mL의 Hoechst 핵 염색으로 슬라이드를 카운터스테인합니다. 과도한 카운터스테인을 제거하기 위해 TBST에서 슬라이드를 한 번 세척합니다. 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 적용합니다. 면역조직화학을 위한 도립광 현미경 또는 면역형광을 위한 컨포칼 형광 현미경으로 슬라이드를 볼 수 있습니다. 6. 음성 대조군 참고: IsoLG에 대한 D11-AP 염색의 특이성을 확인하기 위해 4가지 음성 대조군 실험을 수행할 수 있습니다. 음성 대조군 실험은 동일한 조건에서 동일한 염색 세트에서 수행해야 합니다. 첫 번째 음성 대조군 실험에서 TBST 또는 TBST 단독으로 희석된 D11-AP로 조직을 배양합니다. TBST에 희석된 D11-AP와 TBST에 희석된 D11-AP(AP 링커)가 없는 박테리아 주변세포질 추출물로 조직을 배양합니다. 앞서 설명한 대로 IsoLG/MSA 또는 비내전성 MSA로 경쟁적 분석을 수행합니다12.앞서 설명한19와 같이 마우스 혈청 알부민(MSA)에 첨가된 IsoLG와 IsoLG를 8 IsoLG:1 MSA(8:1 IsoLG/MSA)의 몰비로 준비합니다. D11-AP 1:10을 TBST로 희석합니다. 희석된 D11-AP를 50μg/mL IsoLG/MSA 또는 부가되지 않은 MSA와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 염색을 위해 IsoLG/MSA가 있는 D11-AP 또는 내전되지 않은 MSA가 있는 D11-AP를 조직에 추가합니다. 관련 없는 scFv 항체인 D20을 사용하여 최종 음성 대조군 세트에 대한 조직을 염색합니다.