Capture de composés organiques volatils microbiens produits activement à partir d’échantillons associés à l’homme avec extraction par sorbant assistée par vide

Les composés organiques volatils (COV) sont très prometteurs pour la détection et l’identification bactériennes, car ils sont émis par tous les organismes et différents microbes ont des signatures COV uniques. Les molécules volatiles ont été utilisées comme mesure non invasive pour détecter diverses infections respiratoires, y compris la maladie pulmonaire obstructive chronique¹, la tuberculose² dans l’urine³ et la pneumonie associée au ventilateur⁴, en plus de distinguer les sujets atteints de mucoviscidose (FK) des sujets témoins sains ^5,6. Des signatures volatiles ont même été utilisées pour distinguer des infections pathogènes spécifiques dans la mucoviscidose (Staphylococcus aureus⁷, Pseudomonas aeruginosa ^8,9 et S. aureus vs. P. aeruginosa¹⁰). Cependant, avec la complexité de tels échantillons biologiques, il est souvent difficile d’identifier la source de COV spécifiques.

Une stratégie pour démêler les profils volatils de plusieurs microbes infectieux consiste à effectuer une analyse de l’espace de tête des micro-organismes en monoculture et en co-culture¹¹. L’analyse de l’espace de tête examine les analytes émis dans l’« espace de tête » au-dessus d’un échantillon plutôt que ceux incorporés dans l’échantillon lui-même. Les métabolites microbiens ont souvent été caractérisés en monoculture en raison de la difficulté de déterminer l’origine des métabolites microbiens dans des échantillons cliniques complexes. En profilant les substances volatiles provenant de monocultures bactériennes, les types de substances volatiles qu’un microbe produit in vitro peuvent représenter une base de référence de son répertoire de substances volatiles. La combinaison de cultures bactériennes, par exemple la création de co-cultures, et le profilage des molécules volatiles produites peuvent révéler les interactions ou l’alimentation croisée entre les bactéries¹².

Une autre stratégie pour identifier l’origine microbienne des molécules volatiles consiste à fournir une source de nutriments marquée avec un isotope stable. Les isotopes stables sont des formes naturelles et non radioactives d’atomes avec un nombre différent de neutrons. Dans une stratégie utilisée depuis le début des années 1930 pour tracer le métabolisme actif chez les animaux¹³, le micro-organisme se nourrit de la source de nutriments marquée et incorpore l’isotope stable dans ses voies métaboliques. Plus récemment, un isotope stable sous forme d’eau lourde (D₂O) a été utilisé pour identifier S. aureus métaboliquement actif dans un échantillon clinique d’expectorations de FK¹⁴. Dans un autre exemple, ¹³glucose marqué C ont été utilisés pour démontrer l’alimentation croisée de métabolites entre les isolats cliniques de M. aeruginosa et Rothia mucilaginosa¹² .

Avec l’avancement des techniques de spectrométrie de masse, les méthodes de détection des indices volatils sont passées d’observations qualitatives à des mesures plus quantitatives. En utilisant la spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC-MS), le traitement des échantillons biologiques est devenu à la portée de la plupart des laboratoires ou des milieux cliniques. De nombreuses méthodes d’étude des molécules volatiles ont été utilisées pour profiler des échantillons tels que des aliments, des cultures bactériennes et d’autres échantillons biologiques, ainsi que de l’air et de l’eau pour détecter la contamination. Cependant, plusieurs méthodes courantes d’échantillonnage volatil à haut débit nécessitent un solvant et ne sont pas réalisées avec les avantages fournis par l’extraction sous vide. En outre, des volumes ou des quantités plus importants (supérieurs à 0,5 mL) de matériaux échantillonnés sont souvent nécessaires pour ^{l’analyse 15,16,17,18,19}, bien que cela soit spécifique au substrat et nécessite une optimisation pour chaque type d’échantillon et méthode.

Ici, l’extraction par sorbant assistée par vide (VASE) suivie d’une désorption thermique sur un GC-MS a été utilisée pour étudier les profils volatils des monocultures et co-cultures bactériennes et identifier les volatiles produits activement avec des échantillons d’isotopes stables provenant d’échantillons d’excréments humains, de salive, d’eaux usées et d’expectorations (Figure 1). Avec des quantités d’échantillons limitées, les COV ont été extraits d’aussi peu que 15 μL d’expectorations. Les expériences de sondage isotopique avec des échantillons humains ont nécessité l’ajout d’une source d’isotopes stables, tels que le glucose ¹³C, et de milieux pour cultiver la croissance de la communauté microbienne. La production active de substances volatiles a été identifiée comme une molécule plus lourde par GC-MS. L’extraction de molécules volatiles sous vide statique a permis la détection de molécules volatiles avec une sensibilité accrue 20,21,22.