Aquí se describe el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico, donde se produce un accidente cerebrovascular a través del cráneo intacto mediante la inducción de la oclusión microvascular permanente utilizando iluminación láser después de la administración de un tinte fotosensible.
El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad adulta adquirida en los países desarrollados. A pesar de la extensa investigación de nuevas estrategias terapéuticas, sigue habiendo opciones terapéuticas limitadas para los pacientes con accidente cerebrovascular. Por lo tanto, se necesita más investigación para las vías fisiopatológicas como la inflamación posterior al accidente cerebrovascular, la angiogénesis, la plasticidad neuronal y la regeneración. Dada la incapacidad de los modelos in vitro para reproducir la complejidad del cerebro, los modelos experimentales de accidente cerebrovascular son esenciales para el análisis y la posterior evaluación de nuevos objetivos farmacológicos para estos mecanismos. Además, se necesitan urgentemente modelos estandarizados detallados para todos los procedimientos a fin de superar la llamada crisis de replicación. Como un esfuerzo dentro del consorcio de investigación ImmunoStroke, se describe un modelo de ratón fototrombótico estandarizado que utiliza una inyección intraperitoneal de Rose Bengal y la iluminación del cráneo intacto con un láser de 561 nm. Este modelo permite la realización de ictus en ratones con asignación a cualquier región cortical del cerebro sin cirugía invasiva; por lo tanto, permitiendo el estudio del accidente cerebrovascular en diversas áreas del cerebro. En este video, se demuestran los métodos quirúrgicos de inducción del accidente cerebrovascular en el modelo fototrombótico junto con el análisis histológico.
El accidente cerebrovascular isquémico sigue siendo una de las principales causas de muerte y discapacidad adulta adquirida en los paísesdesarrollados en el siglo XXI, lo que representa aproximadamente 2,7 millones de muertes en 2017 en todo el mundo1. Incluso con los inmensos esfuerzos de la comunidad científica, hay pocos tratamientos disponibles. Además, con criterios de exclusión tan altos, estas opciones ya limitadas no son accesibles para muchos pacientes, lo que resulta en una necesidad urgente de nuevos tratamientos para mejorar la recuperación funcional después del accidente cerebrovascular.
Teniendo en cuenta la incapacidad de los modelos in vitro para replicar las complejas interacciones del cerebro, los modelos animales son esenciales para la investigación preclínica del accidente cerebrovascular. Los ratones son el modelo animal más utilizado en el campo de la investigación del accidente cerebrovascular. La mayoría de estos modelos de ratón tienen como objetivo inducir infartos bloqueando el flujo sanguíneo dentro de la arteria cerebral media (AME), ya que la mayoría de las lesiones de accidente cerebrovascular humano se encuentran en el territorio de la AQM2. Aunque estos modelos recapitulan mejor las lesiones de accidente cerebrovascular humano, implican cirugías convulsas con alta variabilidad del volumen del infarto.
Desde la propuesta de Rosenblum y El-Sabban del modelo fototrombótico en 19773,y más tarde la aplicación de este modelo a ratas Watson et al.4,se ha utilizado ampliamente en la investigación del accidente cerebrovascular isquémico5,6. El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico induce un infarto cortical local y definido como resultado de la fotoactivación de un tinte sensible a la luz previamente inyectado en el flujo sanguíneo. Esto causa trombosis local de los vasos en las áreas expuestas a la luz. Brevemente, tras la exposición a la luz del tinte fotosensible inyectado, se induce una lesión oxidativa localizada de la membrana celular endotelial, lo que lleva a la agregación plaquetaria y la formación de trombos, seguida de una interrupción local del flujo sanguíneo cerebral7.
La principal ventaja de esta técnica reside en su simplicidad de ejecución y la posibilidad de dirigir la lesión a la región deseada. A diferencia de otros modelos experimentales de accidente cerebrovascular, se necesita experiencia quirúrgica menor para realizar el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico a medida que la lesión se induce a través de la iluminación del cráneo intacto. Además, los bordes bien delimitados(Figura 2A y Figura 5B)y la flexibilidad para inducir la lesión a una región específica del cerebro pueden facilitar el estudio de las respuestas celulares dentro del área cortical isquémica o intacta8. Por estas razones, este enfoque es adecuado para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la plasticidad cortical.
En las últimas décadas, la creciente preocupación por la falta de reproducibilidad entre los grupos de investigación se ha acuñado como la llamada crisis de replicación9. Después de la coordinación del primer estudio preclínico aleatorizado controlado multicéntrico en 201510,una herramienta propuesta para mejorar la investigación preclínica11 , 12,13, se confirmó que una causa de falla en la reproducibilidad entre los estudios preclínicos de laboratorios independientes fue la falta de estandarización suficiente de los modelos experimentales de accidente cerebrovascular y los parámetros de resultado14. En consecuencia, cuando se estableció el consorcio ImmunoStroke (https://immunostroke.de/), una colaboración que tiene como objetivo comprender las interacciones cerebro-inmune subyacentes a los principios mecanicistas de la recuperación del accidente cerebrovascular, la estandarización de todos los modelos experimentales de accidente cerebrovascular entre cada grupo de investigación fue esencial.
Aquí se describe el procedimiento estandarizado para la inducción del modelo fototrombótico utilizado en el consorcio de investigación mencionado anteriormente. Brevemente, un animal se sometió a anestésicos, recibió una inyección de rosa de Bengala (10 μL / g) por vía intraperitonal, y el cráneo intacto, a 3 mm que quedaba de bregma, fue iluminado inmediatamente por un láser de 561 nm durante 20 minutos(Figura 1). Además, se informa un método histológico y conductual relacionado para analizar el resultado del accidente cerebrovascular en este modelo. Todos los métodos se basan en procedimientos operativos estándar desarrollados y utilizados en el laboratorio.
El protocolo presentado describe el modelo experimental de accidente cerebrovascular de fototrombosis iluminando el cráneo intacto con un láser de 561 nm, con una inyección intraperitoneal previa de Rosa de Bengala. Hasta hace poco, el uso de este modelo ha sido bajo, pero está aumentando constantemente.
La mortalidad durante la inducción del accidente cerebrovascular en este modelo está ausente. La mortalidad global de menos del 5% surge durante la operación debido a complicaciones ane…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a todos nuestros socios de colaboración de los Consorcios de Immunostroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) por sus sugerencias y discusiones. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania en el marco del Clúster de Munich para neurología de sistemas (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) y bajo las subvenciones LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 y LL-112/1-1.
561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
Forceps | FST | 11616-15 | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Xylacine | Albrecht |