ここで説明するフォトトロンボミックストロークモデルは、感光性染料の投与後にレーザー照明を用いて永久的な微小血管閉塞を誘導することによって無傷の頭蓋骨を通してストロークが生成される。
脳卒中は先進国における死亡および成人障害の主な原因である。新しい治療戦略の広範な調査にもかかわらず、脳卒中患者のための限られた治療選択肢が残っている。したがって、脳卒中後の炎症、血管新生、神経可塑性、再生などの病態生理学的経路に関するより多くの研究が必要である。イン ビトロ モデルが脳の複雑さを再現できないことから、実験ストロークモデルは、これらのメカニズムの新しい薬物標的の分析とその後の評価に不可欠です。さらに、いわゆるレプリケーションの危機を克服するためには、すべての手順の詳細な標準化されたモデルが緊急に必要とされます。ImmunoStroke研究コンソーシアムにおける取り組みとして、ローズベンガルの腹腔内注射を用いた標準化されたフォトトロンボティックマウスモデルと、561nmレーザーによる無傷の頭蓋骨の照明について説明する。このモデルは、侵襲的な手術なしで脳の任意の皮質領域に割り当てるマウスの脳卒中のパフォーマンスを可能にします。したがって、脳の様々な領域での脳卒中の研究を可能にする。本ビデオでは、組織学的分析と共にフォトトロンボティックモデルにおける脳卒中誘導の外科的方法が示されている。
21世紀 の先進国における虚血性脳卒中は依然として死亡の主な原因であり、成人障害を取得し、2017年には世界で約270万人が死亡した1。科学界の膨大な努力があっても、利用可能な治療法はほとんどありません。さらに、このような高い除外基準では、これらの既に限られた選択肢は多くの患者にアクセスできないので、脳卒中後の機能的回復を改善するための新しい治療法が緊急に必要になります。
脳の複雑な相互作用を再現する インビトロ モデルの能力を考慮すると、動物モデルは前臨床脳卒中研究に不可欠です。マウスは脳卒中研究分野で最も頻繁に使用される動物モデルです。これらのマウスモデルの大部分は、ヒト脳卒中病変の大部分がMCA領域2に位置しているため、中大脳動脈(MCA)内の血流を遮断することによって梗塞を誘発することを目的としている。これらのモデルは、より良い人間の脳卒中病変を再現するが、それらは高梗塞体積変動を伴う痙攣手術を伴う。
1977年3月にローゼンブラムとエル・サブバンがフォトトロンボミックモデルを提案して以来、後にワトソンら4匹のラットにこのモデルを適用して、虚血性脳卒中研究5,6で広く使用されるようになった。フォトトロンボミックストロークモデルは、以前に血流に注入された光感受性色素の光活性化の結果として、局所的かつ定義された皮質梗塞を誘導する。これは、光にさらされた領域の血管の局所血栓症を引き起こす。簡単に言えば、注入された感光性色素からの光への暴露時に、内皮細胞膜の局所的な酸化傷害が誘発され、血小板凝集および血栓形成につながり、続いて脳血流の局所的な破壊を引き起こした7。
この技術の主な利点は、その実行のシンプルさと病変を所望の領域に向ける可能性にあります。他の実験的な脳卒中モデルとは異なり、病変が無傷の頭蓋骨の照明によって誘発されるため、光血栓性脳卒中モデルを実行するには、軽度の外科的専門知識が必要である。また、十分に区切られた境界(図2Aおよび図5B)および特定の脳領域に病変を誘導する柔軟性は、虚血性または無傷皮質領域8内の細胞応答の研究を容易にすることができる。これらの理由から、このアプローチは、皮質可塑性の細胞および分子機構の研究に適している。
過去数十年の間に、研究グループ間の再現性の欠如に対する懸念の高まりは、いわゆる複製危機9を作り上げてきた。2015年10年に初の前臨床無作為化対照多施設試験研究の調整後、前臨床研究11、12、13を改善するためのツールが提案され、独立した実験室からの前臨床試験間の再現性が低下する原因の1つは、実験ストロークモデルおよび結果パラメータ14の十分な標準化の欠如であったことが確認された。そこで、脳卒中回復の機構原理の根底にある脳免疫相互作用を理解することを目的とした連携である「ImmunoStrokeコンソーシアム(https://immunostroke.de/)」が設立された際には、各研究グループの実験ストロークモデルの標準化が不可欠であった。
ここで説明した、上記の研究コンソーシアムで使用されるフォトトロンボティックモデルの誘導のための標準化された手順である。簡単に言えば、動物は麻酔薬を受け、腹腔内にローズベンガル注射(10μL/g)を受け、ブレグマから3mm残された無傷の頭蓋骨を、561nmレーザーで20分間すぐに照射した(図1)。さらに、このモデルでの脳卒中の結果を分析するための関連する組織学的および行動的方法が報告される。すべての方法は実験室で開発され、使用される標準的な操作手順に基づいている。
提示されたプロトコルは、ローズベンガルの以前の腹腔内注射で、561 nmレーザーで無傷の頭蓋骨を照らすことによってフォトトロンボシスの実験的なストロークモデルを記述する。最近まで、このモデルの使用は低く、着実に増加しています。
このモデルにおける脳卒中誘導時の死亡率は存在しない。麻酔合併症または排除基準を満たした後の犠牲のために、手術中に5%…
The authors have nothing to disclose.
免疫ストロークコンソーシアム(FOR 2879、免疫細胞から脳卒中回復まで)のすべてのコラボレーションパートナーに、提案と議論に感謝します。この研究は、ドイツのドイツ・フォルシュングスゲマイインシャフト(DFG、ドイツ研究財団)が、ミュンヘン・クラスター・フォー・システム・ニューロロジー(EXC 2145 SyNergy – ID 390857198)の枠組みの下でドイツのエクセレンス戦略に資金を提供し、助成金LI-2534/7-1、LI-2534/7-1およびLL-112/1-1.1の助成金を受けました。
561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
Forceps | FST | 11616-15 | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Xylacine | Albrecht |